NIPT-plus检测技术在高危孕妇产前诊断中的应用研究

段妔 李林艳 万雪 余江 徐敏 郑艺 范振海 余丽梅

生育缺陷给社会与家庭带来极大的困扰及非常沉重的经济负担，尤其是国家施行二孩及三孩政策放开以来，高龄孕妇明显增多，生育风险增大。因此，人们对优生优育质量及产前筛查意识不断增强，产前诊断受益人群随之扩大[1-2]。如何进行有效的产前筛查，降低出生缺陷，已成为国家、社会及家庭关注的重点。现阶段，扩展性无创产前基因检测技术（noninvasive prenatal testing-plus，NIPT-plus）在高危孕妇人群产前诊断中的应用研究，是当前基于高通量测序检测的一项产前筛查新技术，也是对孕妇母体外周血浆中的胎儿游离DNA 进行测序来检测胎儿21- 三体、18- 三体、13- 三体染色体非整倍体异常以及亚显微结构异常（微缺失/ 微重复）所致胎儿生长发育畸形、器官功能障碍及智力低下或残疾等缺陷的有效手段[3-4]。它可有效筛查高危孕妇产前胎儿染色体异常疾病的风险，提高优生优育质量。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2021 年1 月—2022 年12 月就诊于遵义医科大学附属医院产前诊断中心的5 085 例孕妇，观察指标包括高龄孕妇≥35 岁、 B 超提示异常信息、产前筛查血清学存在高风险。经孕妇自愿同意后接受 NIPT-plus 检测技术，对阳性结果的孕妇采取羊水细胞穿刺术检测，分析染色体异常因素。（1）纳入标准：自然受孕、单胎、妊娠期满13 ～24 周，明确产前筛查指征：①高危孕妇年龄；②孕妇血清学高风险筛查；③超声影像学异常指标筛查；④孕妇不良孕产史等。（2）排除标准：非自然受孕、多胎、有传染病史（如肝炎、结核、HIV 阳性等）、恶性肿瘤、近期有先兆流产征象或在1个月内接受过外源DNA 的免疫治疗，以及孕妇在1 年内有输血史等其他侵入性产前诊断禁忌证。（3）临床资料的收集：①建立遗传咨询病例登记；②查阅遗传咨询孕妇的相关检查资料；③详细记录高危孕妇的年龄、胎龄、孕产史、家族史、不良接触史、产前筛查项目及超声筛查结果等。（4）检测流程：抽取孕妇外周血10 mL 左右，对血浆中胎儿游离DNA 进行测序，检测13，18，21 三体及性染色体异常等指标。经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准检测阳性样本，父母溯源外周血染色体核型分析。

1.2 方法

1.2.1 孕妇血浆提取

EDTA 采血管采集孕妇静脉血10 mL 左右。1 600 rpm离心10 min；小心吸取表层血浆于EP 管中，16 000 rpm 离心10 min，沉淀备用。

1.2.2 胎儿游离DNA 提取

参照QIAampDNA Blood mini kit 试剂盒说明书进行血浆DNA 提取操作。

1.2.3 NIPT-plus 检测

在 BGISEQ-500 测序平台采用胎儿染色体非整倍体检测试剂盒（联合探针锚定连接测序法）进行全基因组大规模平行测序。

1.2.4 培养羊水细胞

羊膜腔穿刺术必须确保安全无菌，在B 超引导下进行操作。抽取羊水约20 mL，分别装入2 个10 mL的无菌塑料离心管中，1 500 rpm 离心10 min。在超净工作台中进行去上清液操作，保留约0.5 mL 羊水；与沉淀混匀后接种于2 个细胞培养瓶内，置于5%CO2培养箱中37 ℃静置培养7 ～10 d，观察得到分裂中期的细胞。收获前1 h 用秋水仙素处理，再经过低渗、固定、滴片、胰酶消化、G 显带等一系列实验操作制备染色体。

1.2.5 羊水细胞染色体核型分析

正常核型：每张玻片计数核型30 个，并对其中显带清楚、形态良好的5 个分裂相进行分析。

异常核型：根据异常核型种类的不同，核型计数增加至50 ～100 个。核型分析数量也相应增加，有必要的情况下还需加做 N 显带或C 显带进行分析，以确定染色体结构异常及其多态性。

1.3 观察指标

（1）NIPT-plus 结果提示染色体数目异常的高风险病例，如经羊水细胞染色体核型分析未见相应染色体数目异常，则提示NIPT-plus 结果为假阳性。

（2）NIPT-plus 结果提示染色体结构异常的高风险病例，如经羊水细胞染色体核型分析，且有必要的情况下加做特殊染色体显带，均未见相应染色体结构异常，则提示NIPT-plus 结果为假阳性。

（3）本研究分析异常核型均参照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）2020》标准进行描述[5-7]。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 24.0 统计学软件对数据进行分析。计数资料用n（%）表示，计量资料用（±s）表示。P＜ 0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 病例基本情况

本研究总共病例数为5 0 8 5 例，年龄3 5 ～5 0岁，平均（3 7±2）岁，其中3 5 ～4 5 岁年龄段为5 0 0 0 例，＞4 5 岁年龄段为8 5 例。纳入时平均孕周（1 6.0±2.0）周。

2.2 NIPT-plus 检测结果及阳性预测指标

共检测5 085 例患者中，共筛出51 例高风险病例，其中8 例21- 三体、9 例18- 三体、1 例13- 三体、14 例性染色体、19 例其他染色体异常。51 例异常病例均行羊膜腔穿刺检测结果证实有21 例确诊异常，其中有7 例21- 三体（阳性87.50%）、2 例18-三体（阳性率22.22%）、8 例性染色体异常（阳性率57.14%）、其他染色体异常4 例（阳性率21.05%），见表1。

表1 NIPT-plus 对高龄孕妇产前筛查胎儿染色体异常的结果

2.3 染色体 G 显带核型检测结果分析

5 085 例孕妇中，共筛出51 例异常病例，行羊膜腔穿刺术之后检测结果证实存在21 例确诊异常，见表2。其中21 例中涉及临床常见染色体非整倍体异常13 例，分别为染色体核型是47，XN，+21 者7 例、染色体核型是47，XN，+18 者2 例，染色体核型是47，XXY者4 例，异常占比分别为0.14%、0.04%，0.08%。47，XN，+21、47，XN，+18、47，XXY 异常染色体核型见图1 ～图6。

图1 箭头标注区为原图异常染色体

图2 47，XN，+21

图3 箭头标注区为原图异常染色体

图4 47，XN，+18

图5 箭头标注区为原图异常染色体

图6 47，XXY

表2 13 例染色体数目异常核型结果

3 讨论

随着我国人口老龄化进程的不断发展，为优化我国人口比例，国家先后出台了开放二胎、三胎的生育政策。近年来，有些城市更是提出了鼓励一对夫妇生育三胎的政策优惠措施，鼓励适龄女性提升生育率[8-9]。因此，高龄孕产妇明显增多，由染色体异常所导致的生育缺陷风险也随之增多，孕前健康体检、产前染色体疾病健康筛查显得尤为重要。针对这些高危孕妇进行无创基因产前筛查和染色体产前诊断可有效降低生育缺陷的风险。现阶段，我国通常采用新一代高通量测序技术用于孕妇外周血胎儿游离DNA 的无创产前筛查，该技术具有早期发现、无创、安全、准确、规范、便捷、快速、成本低等优势，在临床应用中越来越广泛[10-11]。近年来，采用NIPTplus 对常见的21- 三体综合征、18- 三体综合征和13-三体综合征的筛查准确性得到一致认同[12-13]。然而，在临床实践中仍旧不断出现NIPT-plus 检测假阴性及假阳性的结果。本研究共筛查5 085 例患者中，筛出51 例NIPT-plus 检测高风险病例，完全涵盖了染色体异常分类中的染色体数目异常和结构异常。当然，主要包括临床常见的染色体非整倍体异常以及亚显微结构的缺失或重复异常，这其中有8 例21-三体、9 例18-三体、1 例13-三体、14 例性染色体、19 例其他染色体异常；对51例NIPT-plus 检测高风险病例均行羊水细胞染色体核型分析，结果证实存在21 例病例异常，其中有7 例21-三体异常（阳性率为87.50%）、2 例18- 三体异常（阳性率为22.22%）、8 例性染色体异常（阳性率为57.14%）、其他染色体异常4 例（阳性率为21.05%）。

从本研究结果来看，NIPT-plus 在检测技术层面与羊膜腔穿刺染色体核型分析检测结果存在差异，原因分析可能与下列因素相关：（1）NIPT-plus 检测过程中存在极大的可能性被孕妇自身异常的 DNA 干扰，从而导致无创结果与核型分析结果不相符[14-16]。（2）可能导致 NIPT-plus 检测结果出现性染色体非整倍体高风险异常的因素有以下几种[17]，如性染色体互换、母体染色体嵌合、限制性胎盘嵌合、胎盘滋养层细胞等因素。因此，针对NIPT-plus 检测结果提示性染色体异常的高风险病例，进一步进行羊膜腔穿刺术，并对羊水标本采用染色体核型分析、荧光原位杂交、分子核型分析等其他染色体及分子检测技术，对于确诊异常病例具有非常重要的意义[19-20]。虽然临床医师对于NIPTplus 的准确性和无创性普遍认可，但也存在假阳性病例的概率。因此，临床上建议NIPT-plus 可作为高风险孕妇产前筛查的技术手段，必要时需联合羊膜腔穿刺进行羊水细胞染色体核型分析进一步确诊。

综上所述，NIPT-plus 作为 NIPT 的升级版，是检测胎儿13、18、21 染色体非整倍体异常以及亚显微结构异常（微缺失/微重复）所致胎儿生长发育畸形、器官功能障碍及智力低下或残疾等缺陷的有效手段[20-21]。该技术在高危孕妇产前筛查中对胎儿染色体异常风险的诊断与鉴别诊断具有重要意义，其研究结果可为产前诊断后期标准制定提供借鉴内容。