IL-6-572C/G、IL-6-174G/C基因多态性与梅毒感染的相关性分析

张英 李海燕 王西珍

梅毒是由梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）感染引起，是通过性传播、母婴传播的一种慢性性病，梅毒感染可以增加人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的感染和传播风险。根据全国性病病例报告，1989—2019 年以来，梅毒感染病例的报告率呈逐年增长趋势，加重了全球公共卫生负担[1-2]。梅毒发病机制尚未完全明确，有研究发现重组梅毒螺旋体蛋白Tp0768 通过激活NF-κB 通路和JNK 通路诱导白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）的表达，与健康对照组相比，梅毒患者IL-6、IL-2、IL-10 血清表达水平均明显增高，在梅毒感染的起病、进展及预后中机体免疫应答、基因、遗传易感性在发挥关键作用[3-4]。以往研究证实IL-6 基因启动子区域的核苷酸基因多态性，可以导致基因转录和表达发生变化，影响个体对炎症及多种免疫性疾病的易感性[5-6]，目前有关TP 感染与IL-6-572C/G、IL-6-174G/C 启动子区单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism，SNP）未见报道，本研究旨在探讨IL-6（-572C/G、-174G/C）SNP 与梅毒感染的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入2020 年5 月—2021 年5 月至连云港市第二人民医院就诊的门诊、住院梅毒确诊患者80 例作为试验组，男性35例，女性45例；年龄32～82岁，平均（48.59±11.74）岁。根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会行业标准（WS273—2018）中的《梅毒诊断》[7]进行梅毒感染疾病分期，其中轻度感染组为Ⅰ期、Ⅱ期共60 例，年龄32 ～77 岁，平均（47.58±12.78）岁；重度感染组为Ⅲ期共20 例，年龄32 ～84 岁，平均（49.02±11.36）岁。同时期至连云港市第二人民医院体检中心体检的健康人作为对照组，共120 例，包括男性63 例，女性57 例，年龄27 ～88 岁，平均（50.98±17.46）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获得江苏省连云港市第二人民医院伦理委员会批准（批件号：2019-029），研究对象均签署了知情同意书。

纳入标准：（1）经化学发光法检测梅毒螺旋体抗体（treponema pallidum antibody，TP-Ab）阳性，甲苯胺红不加热血清（tolulized red unheated serum test，TRUST）试验验证阳性。（2）在连云港市第二人民医院诊治前3 个月内没有任何免疫调节剂、激素类以及抗菌药物的使用史。排除标准：（1）伴有其他性传播疾病者。（2）妊娠期及哺乳期妇女。

1.2 主要仪器及试剂

雅培全自动免疫分析仪i2000 仪器（德国Abbott 公司）；数显混匀器WZR-H6000（春妙上海医疗器械有限公司）；PCR 仪器（ABI Verti）；核酸电泳及凝胶成像系统（北京六一生物科技）；高速离心机（Thermo Fisher）；TRUST 诊断试剂盒（上海荣盛药业有限公司）；天根DNA 提取试剂盒（天根生化北京有限公司）；M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（北京聚合美生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

在NCBI数据库中下载从loci 22726410至loci 22727184的基因序列，包含IL-6基因 rs1800795（loci 22727026）、rs1800796 （Loc22726627）位点，用Snapgene 5.0.5软件设计扩增目的基因的P C R 引物，引物序列如下：上游:5'- GCCAACCTCCTCTAAGTG-3'，下游: 5'-TCAGACATCTCCAGTCCTAT-3' ，委托杭州有康生物技术有限公司合成。

1.3.2 标本收集

研究对象清晨空腹6 ～8 h， 静脉采血收集EDTA-K2抗凝全血和血清各5 mL。血常规检测正常者，血清采用雅培全自动免疫分析仪i2000 仪器检测TP-Ab 浓度，阴性的标本纳入本次试验的健康对照组。TP-Ab 检测阳性者同时采用TRUST 试验进行验证，按照诊断试剂盒说明书操作，阳性者作为试验组，将收集的标本置于-80 ℃储存备用。

1.3.3 扩增目的基因

天根DNA 提取试剂盒提取500 μL 外周全血的DNA，严格按照操作说明书进行。DNA 产物浓度≥100 ng/μL 符合要求，在PCR 仪上反应扩增，扩增条件：95 ℃、5 min，1 个循环；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 个循环；72 ℃、5 min，1 个循环，16 ℃ 持续。扩增产物取5 μL 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，收集出现目的条带的扩增产物，放至-80 ℃储存备用。

1.3.4 研究产物测序

样本的扩增产物委托杭州有康生物技术有限公司，样本双向测序，采用Sanger 双脱氧终止测序法，在ABI3730xl全自动测序仪上进行。3730 Data Collection v3.0 软件收集实验数据，FinchTV（1.4.0 版）软件分析IL-6-572C/G和IL-6-174G/C 位点基因多态性，分别采用rs1800796 和rs1800795 位点后10 个碱基，定位变异碱基的位置。

1.4 观察指标

试验组和对照组年龄、性别基础资料分布，目的基因测序结果，rs1800796（IL-6-572C/G）、rs1800795（IL-6-174G/C）等位基因频率、基因型以及不同遗传模式下试验组和对照组的基因型分布。

1.5 统计学方法

采用SPSS22.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料采用（±s）表示，两样本均数的比较采用t检验；计数资料采用n（%）表示，基因型和等位基因频率采用直接计数法，两组间比较采用χ2检验；Logistic 回归模型分析IL-6 基因多态性和梅毒感染的相关性。P＜ 0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 对照组与试验组患者一般资料比较

对照组与试验组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；轻度感染组与重度感染组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1、表2。

表1 对照组与试验组临床一般资料比较

表2 重度感染组与轻度感染组临床一般资料比较

2.2 目的基因扩增及测序

IL-6 基因目的片段扩增产物有771 bp，在 750 bp DNA标记物的附近。连云港地区汉族人群IL-6-572C/G 等位基因有C 和G，基因型可见CC、CG 和GG 3 种；IL-6-174G/C 等位基因包括C、G，基因型可见GG 和CG 2 种，见图1。

图1 IL-6 启动子区-572 和-174 位点基因多态性测序结果

2.3 Logistic 回归分析IL-6 基因多态性和梅毒感染的相关性。

IL-6-174G/C 和-572C/G 多态性在试验和对照组中的分布频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡（P＞0.05）。比较健康对照组和试验组IL-6-572C/G 基因型和等位基因频率，与CC 基因型相比，CG 和GG 两组与梅毒感染组差异均无统计学意义（P＝O.428，OR＝1.75，95%CI0.44 ～6.97；P＝0.351，OR＝1.94，95%CI0.48 ～7.86），等位基因C和G 频率在对照组和试验组无明显变化（P＝0.817，OR＝1.05，95%CI0.67 ～1.67），在显性遗传、隐性遗传、共显性遗传等不同的遗传模式下，基因型 CG+GG 和 CC，CC+CG 和GG，CC、CG 和 GG 都与梅毒感染不相关。IL-6-174C/G 基因型可见GG 与GC，等位基因G 和C，试验组和对照组可见分布差异无统计学意义（P＝0.773，OR＝0.66，95%CI0.04 ～10.77，P＝0.874，OR＝0.66，95%CI0.04 ～10.71），见表3。

表3 IL-6-572C ＞G、-174C/G 等位基因频率、基因型以及不同遗传模式下的基因型分布 [ 例（%）]

3 讨论

梅毒感染病变可累及皮肤、眼、骨头、神经系统、心血管、肾脏、肝脏等多器官和脏器，引发严重的并发症和死亡率。逃避免疫监视是梅毒感染的重要发病机制，梅毒螺旋体入侵机体早期，首先T 淋巴细胞介导的细胞免疫被激活，并在清除病原体中发挥重要作用。随着病情进展到晚期，患者细胞免疫防御能力下降，Th1/Th2 细胞等免疫细胞及其分泌的细胞因子（TNF-α、IL-6 等）出现动态变化。梅毒螺旋体感染后增殖期，引发迟发性超敏反应，致敏CD4+T 细胞被激活，并在局部增殖并释放、吸引和激活巨噬细胞的细胞因子，而迟发性超敏反应无效时则转变为慢性病变。而免疫细胞分泌炎症因子能够调节机体的免疫应答，IL-6 为重要的免疫细胞因子。研究发现神经梅毒患者血清和脑脊液中 IL-6、IL-10 的含量明显高于对照组，但是血清中的 IL-2、IL-12和 IFN-γ 含量低于对照组[8]。课题组前期研究发现江苏省连云港地区梅毒患者IL-6 浓度比对照组显著升高，而且Ⅲ期患者IL-6 血清浓度明显高于Ⅱ期和I 期患者，说明IL-6 在梅毒感染的发生、发展过程中发挥了重要的作用。另有研究显示 IL-6 基因启动子区域中 SNP 对该基因的表达具有明显的影响[9]。近年来IL-6 多态性研究广泛，已经证实其SNP 和多种免疫性及感染性疾病相关性显著。笔者推测梅毒患者IL-6 启动子区域位点基因多态性，在梅毒感染过程中有一定的作用。

IL-6 主要由活化的单核细胞分泌，生理状态下其水平较低，在病原体刺激下，表达量显著升高。IL-6 表达受转录严格调控，IL-6 基因位于7p21 染色体上，全长5 kb，含有5 个外含子。IL-6 基因多态性主要表现在5'端启动子区域-572、-174 等位点的G/C，G/A 单核苷酸变异。余波等[10]发现急性脑梗合并肺部感染患者IL-6 基因-572G 基因频率较高，且基因型GG 频率较高，G 基因可能是易感基因。另有研究发现，脓毒血症患者IL-6 基因启动子区-572C/G 基因型CC 及等位基因C 频率明显低于对照组，基因型GG 及等位基因G 频率明显高于对照组，脓毒血症患者血清IL-6水平显著高于健康组[11]。本研究发现IL-6 启动子区-572 等位基因有C 和G，基因型有CC、CG 和GG3 种，IL-6 启动子区-174 等位基因有C、G，基因型有GG 和CG 两种，与上述研究发现一致。但是课题组进一步研究发现梅毒患者IL-6-174 基因型GG、CG 以及等位基因C 和G 频率与健康人群中的分布并差异无统计学意义（P＞ 0.05），IL-6-572 3 种基因型和等位基因频率和健康者同样差异无统计学意义（P＞ 0.05），同时在显性遗传模式、隐性遗传模式、共显性遗传模式下，试验组和健康对照组之间均没有关联，这提示IL-6 启动子区域-572 和-174 位点多态性与梅毒感染易感性无关。既往研究表明，梅毒感染与多个遗传位点的SNP 联合作用有关，即可能存在梅毒感染患病相关的基因间存在SNP 位点间的交互调控作用，且相关基因位点间的单体型也可能增大梅毒感染的患病风险[12-14]。这也进一步提示梅毒感染是由先天性免疫、遗传易感性等共同作用的结果。

综上所述，本研究首次证实IL-6-572C/G 和IL-6-174G/C 基因多态性与梅毒易感性没有关联，为后续IL-6基因多态性与梅毒感染的位点研究提供选择依据。同时也存在一定的局限性：是小样本单中心研究，仅分析了IL-6启动子区2 个位点多态性，需要更大样本多中心以及涉及IL-6 5'端和3'端多个位点的基因多态性的综合研究，明确IL-6 基因SNP 与梅毒感染的相关性。文章中体现了中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会行业标准（WS273—2018）中的梅毒诊断执行标准[7]。