肺泡灌洗液结核杆菌RNA、T-SPOT在菌阴肺结核诊断中的应用

张帆 林健 林芬

肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的慢性呼吸道传染病，是全球公共卫生问题之一[1]。根据世界卫生组织的《结核病》报告，2019 年全球有1 000 万人患有肺结核，其中150 万人死亡。根据痰涂片和培养的结果，肺结核可分为菌阳性和菌阴性两种。菌阴肺结核是指3次痰涂片及1次培养阴性的肺结核，其发生率占肺结核的30%～40%。菌阴肺结核的诊断主要依靠临床表现、影像学和组织病理学，但这些方法存在局限性和不确定性，导致诊断困难和误诊率高[2]。因此，探讨菌阴肺结核的诊断标准和方法，对于提高诊断准确性、降低传播风险、指导合理治疗具有重要意义。肺泡灌洗液是一种从肺泡中获取的液体样本，可以反映肺部炎症和感染的情况。肺泡灌洗液可以检测到结核分枝杆菌的RNA、培养、涂片和结核感染T 细胞斑点试验（T cell spot test，T-SPOT）等指标，可能对菌阴肺结核的诊断有帮助。本文旨在探讨肺泡灌洗液中结核杆菌RNA、X-pert、涂片检查及T-SPOT 在菌阴肺结核诊断中的价值，为临床提供参考依据。本研究的方法和结果均基于中华人民共和国卫生行业标准的《肺结核诊断》。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取2022 年7 月1 日—2022 年9 月26 日在某医院呼吸科就诊的诊断为肺结核患者202 例。根据痰涂片和培养的结果，分析菌阴肺结核患者的基本资料，其中涉及患者的性别、年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、接触史等基线资料。其中诊断为菌阴肺结核病例134 例，其中男性75 例，女性59 例，年龄18 ～75 岁，平均（45.61±2.32）岁，BMI（21.46±3.40） kg/m2；41 例有吸烟史，93 例无吸烟史；36 例有饮酒史，98 例无饮酒史；22 例有接触史，112 例无接触史。本研究经医院医学伦理委员会批准，同意参与本研究并签署知情同意书。

纳入标准：（1）有肺结核临床症状，如咳嗽、咳痰、咯血、发热、盗汗、消瘦等。（2）胸部X 线或CT 检查有肺结核特征性改变，如空洞、纤维化、钙化、粟粒结节等。排除标准：（1）入院后痰结核菌涂片阳性患者。（2）有免疫缺陷或使用免疫抑制剂等影响免疫功能的情况。（3）有严重的心、肝、肾等器官功能不全或血液系统疾病。（4）拒绝接受肺泡灌洗液检查或无法获取足够的肺泡灌洗液样本。（5）有其他肺部感染或肿瘤等并发症。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液检查

所有患者在空腹、清醒状态下，经纤维支气管镜插入病变部位，用生理盐水（37 ℃）以20 ～40 mL/次，共100 ～200 mL 进行肺泡灌洗，回收率≥50%。将肺泡灌洗液用于涂片、培养、X-pert（X-pert MTB/RIF system）、X-pertR（X-pert MTB/RIF ultra）耐药[3]、结核脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、结核RNA、菌种鉴定、位点检出和位点突变、以及T-SPOT 检测，即11 种检测方法。

1.2.2 涂片检查

将肺泡灌洗液离心后，取沉淀物制作玻片，进行抗酸染色和荧光染色，用显微镜观察是否有结核分枝杆菌。每张玻片至少观察100 个高倍视野，按照国际防治结核病和肺部疾病联盟（The International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD）的标准进行评价[4]。

1.2.3 培养检查

将肺泡灌洗液离心后，使用MGIT960 仪器，取沉淀物接种于Lowenstein-Jensen 培养基和BACTEC MGIT 960 液体培养系统中，分别在37 ℃下培养4 ～8 周和6 ～8 周，观察是否有结核分枝杆菌生长。对于生长出的结核菌株，采用比例法进行培养耐药试验，测试异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素等药物的敏感性。

1.2.4 X-pert 检测

将肺泡灌洗液离心后，取沉淀物加入样本试剂管中，振荡混匀后放入赛沛仪器中，按照厂家说明书进行操作。该仪器可以同时检测结核分枝杆菌的DNA 和利福平耐药基因突变（rpoB 基因），结果在2 h 内出现。

1.2.5 X-pertR 耐药检测

将肺泡灌洗液离心后，取沉淀物加入样本试剂管中，振荡混匀后放入Gene X-pert MTB/RIF Ultra 仪器中（美国Cepheid 公司生产），按照厂家说明书进行操作。该仪器可以同时检测结核分枝杆菌的DNA 和利福平耐药基因突变（rpoB 基因），并且比X-pert 更敏感和特异，结果在80 min内出现。

1.2.6 结核DNA 检测

将肺泡灌洗液离心后，使用ABI7500 仪器平台取沉淀物提取DNA，采用实时荧光PCR 法扩增结核分枝杆菌特异性基因片段整合子序列6110（insertion sequence 6110，IS6110） 和16S 核 糖 体RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料进行荧光定量。根据扩增曲线和阈值循环数（cycle threshold，Ct）判断是否阳性。

1.2.7 结核RNA 检测

将肺泡灌洗液离心后，取沉淀物提取RNA，采用逆转录实时荧光PCR 法扩增结核分枝杆菌特异性基因片段16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA），并用SYBR Green I 染料进行荧光定量。根据扩增曲线和阈值循环数（Ct值）判断是否阳性。

1.2.8 菌种鉴定

对于培养阳性的结核菌株，在博奥晶典仪器平台下，采用PCR- 限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）法进行菌种鉴定。提取菌种的DNA，扩增hsp65基因，并用BstEII 酶切割产生不同长度的片段。将切割产物进行电泳分离，并与已知的参考菌株进行比较，确定菌种。

1.2.9 位点检出

对于培养阳性的结核菌株，同样使用博奥晶典仪器平台，采用PCR-单链构象多态性（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）法进行位点检出。提取菌株的DNA，扩增katG、inhA、rpoB 等与耐药相关的基因，并用变性凝胶电泳分离产生不同构象的单链DNA。将电泳图像与已知的正常或突变型进行比较，确定是否有位点突变。

1.2.10 位点突变

对于位点检出阳性的结核菌株，采用PCR- 直接测序法进行位点突变分析。提取菌株的DNA，扩增与位点检出相同的基因，并用自动测序仪进行双向测序。将测序结果与已知的正常或突变型进行比较，确定突变类型和位置。

1.2.11 T-SPOT 检测

将血液离心后，取细胞悬液加入T-SPOT 试剂盒中（由英国Oxford Immunotec Ltd 生产），按照厂家说明书进行操作。该试剂盒可以检测患者外周血单个核细胞对结核特异性抗原早期分泌抗原目标-6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培养滤液蛋白-10（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激后释放的干扰素-γ 水平。根据斑点数判断是否阳性。

1.3 观察指标

本研究的主要评估指标为各种检测方法计算出菌阴肺结核患者的阳性率、阳性预测值、阴性预测值；阳性率是指检测出阳性结果的比例，反映了检测方法的敏感性，即能够发现患者的能力。阳性预测值是指阳性结果者中患者的比例，反映了检测方法在特定人群中阳性结果的可信度，与患病率有关。阴性预测值是指阴性结果者中非患者的比例，反映了检测方法在特定人群中阴性结果的可信度，也与患病率有关[5]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据处理和分析。单变量统计分析各种检测方法的阳性率、阳性预测值、阴性预测值。

2 结果

不同的结核病检测方法在不同指标上的表现存在很大的差异。比如，T-SPOT 方法的阳性率最高（82.8%），表明该方法最敏感，能够检测出大部分患者。同样，其阳性预测值也最高（82.8%），说明在阳性结果者中患者的比例最高，也就是说假阳性率最低。这意味着T-SPOT 方法虽然能够发现大多数患者，但也会漏诊一些患者。其次，涂片方法的阳性率最低（11.9%），说明它最不敏感，只能检测出少数患者。其他方法的阳性率、阳性预测值和阴性预测值都较低，说明它们在诊断方面的效果都不理想。因此，选择合适的结核病检测方法需要综合考虑多个指标，并根据具体情况进行权衡，见表1。

表1 不同检测方法的比较（%）

3 讨论

肺泡灌洗液结核杆菌RNA、培养、涂片检查及结核感染T-SPOT 是目前用于诊断菌阴肺结核的常用方法[6-7]。菌阴肺结核是指在临床上有结核病症状和体征，但在痰涂片或培养中未能检出结核分枝杆菌的患者[8]。菌阴肺结核的诊断难度较大，容易漏诊或误诊，影响患者的治疗效果和预后，也增加了结核病的传播风险[9]。因此，探讨肺泡灌洗液结核杆菌RNA、X-pert、涂片检查及T-SPOT 在菌阴肺结核诊断中的价值具有重要的临床意义和研究价值。

结果显示，T-SPOT 方法是最能检测菌阴肺结核患者的方法，其阳性率和阳性预测值都是最高的，但也有最高的假阴性率，可能会漏掉一些患者。涂片方法的阳性率和阳性预测值都是最低的，但也有最低的假阳性率，可能会多诊断一些患者。X-pert 方法和菌种鉴定方法的阳性率都比较中等，但其在识别患者方面稍微好一点，其阳性预测值和阴性预测值都比菌种鉴定方法高一点。其他方法在诊断方面都不太好，阳性率、阳性预测值和阴性预测值的值也验证了这一点。这一结果与世卫组织的《结核病》报告中推荐的检测方法相一致，也与国内外其他相关研究基本一致[10-12]，也显示了本文方法在菌阴肺结核诊断中的创新性。如果要选择一个检测方法来指导临床工作，建议选择T-SPOT 方法或X-pert方法[13-14]，因为它们具有较高的阳性率和阳性预测值，能够准确地识别出大部分患者，并且避免不必要的干预。还需要考虑其他因素，如检测成本、可用性、时间等，进行综合评定[15]。

未来阶段的工作重点主要有以下几点：（1）进一步优化肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法的操作流程和技术参数，提高其稳定性和可重复性。（2）进一步扩大样本量，增加对照组和随访时间，评估肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法在不同类型和程度的菌阴肺结核患者中的应用价值和准确度。同时，也需要探讨肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法与其他方法（如X-pert MTB/RIF、LAMP 等）的联合应用效果，以提高菌阴肺结核诊断的敏感性和特异性。开展多中心、大样本、前瞻性的临床试验，验证肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法在不同人群和地区的适用性和准确性。（3）探索肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法在监测治疗效果、预测复发风险、指导用药方案等方面的作用和意义。以及探讨肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法在耐药结核分枝杆菌和位点突变分析方面的作用和意义。

综上所述，本文探讨了肺泡灌洗液结核杆菌RNA、X-pert、涂片检查及T-SPOT 在菌阴肺结核诊断中的价值，发现T-SPOT 方法和X-pert 方法具有较高的阳性率和阳性预测值，能够准确地识别出大部分患者，是较为可靠的诊断方法。本文的结果与最新的研究文献基本一致，也显示了本文方法在菌阴肺结核诊断中的创新性。但是，本文也存在一些局限性，如样本量较小、没有进行受试者工作特征曲线分析和成本效益评估等，需要在未来的工作中进行改进和完善。同时，也需要进一步探索肺泡灌洗液结核杆菌RNA 检测法在监测治疗效果、预测复发风险、指导用药方案等方面的应用价值和意义，以及在耐药结核分枝杆菌和位点突变分析方面的作用和意义。本文为菌阴肺结核的诊断提供了一种新的思路和方法，为临床工作和科学研究提供了一定的参考和借鉴。