雅解益栽(心)方对动脉粥样硬化的大鼠脂代谢和氧化应激及炎性反应作用研究

骆始华 李 易 赵丽娟 陶希睿 刘中勇 段小花 张 超*

1.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650000；2.云南省中医医院，云南 昆明 650000；3.《中国民族民间医药》杂志社，云南 昆明 650021；4.江西中医药大学第一附属医院，江西 南昌 3300043

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础[1]。而其所引起的心血管疾病(cardio vascular disease，CVD)已经成为威胁人类健康的首要死因。动脉粥样硬化是心血管病中最主要的一种，其典型的病变特征是脂质、炎症细胞、平滑肌细胞和坏死细胞碎片在血管内壁单层内皮细胞下方的内膜腔内终生积累和转化。AS发病机制复杂，目前较一致的看法是因脂质代谢紊乱、炎症细胞浸润、氧化应激等多机制相互作用的结果，其发病过程十分复杂；在过去的几十年里，广泛的研究试图揭示疾病背后的发病机制因此，积极寻找有效防治AS的策略，对于降低CVD的发病率和死亡率具有十分重要的科学意义[2]。西医学针对AS及易损斑块的治疗手段主要有他汀类药物和介入治疗。介入治疗虽可改善血管狭窄，但介入后再狭窄及对没有从根本上解决血管斑块的生物学特性；他汀类药物可降脂、逆转斑块形成、抑制炎症从而降低心脑血管事件，但其可导致肝肾损伤、横纹肌溶解、肌痛及认知能力降低等副作用。而中医药在防治AS疗效确切，其抗AS机制具有多角度、多靶点干预的优势有望在一定程度上稳定斑块、减少心脑血管事件的发生。

雅解益栽(心)方(以下简称YJYXF)是从傣医临床文献资料中收集整理的民族有效验方，傣医本科教材《傣医临床学》中将“食物毒”定义为：“食物毒”是指因过食导致“四塔”“五蕴”的失衡，毒邪内蕴，内伤脏腑而发病。临床表现包括全身症状等，如循环系统表现为心慌、心悸、胸痛等症，还可以表现为下肢紫绀、坏疽等症。“雅解益栽(心)方”具有调节体内“四塔、五蕴”功能，解除人体毒素，保护脏腑功能的解毒方。YJYXF的药物中的药物组成，即雅解先打(傣百解)、文尚海(百样解)性凉，入风、火、水、土塔，调四塔，解酒毒、热毒和其他毒，护脏腑为主药；全方合用具有调补四塔、清火解毒之作用，可达调补气血，解热毒、酒毒、食物中毒及保护心肝肾之目的[3]。本研究从傣医的“雅解”理论出发，通过高脂饲料建立动脉粥样硬化模型来模仿傣医学“食物毒”的模型，观察雅解益栽(心)方对AS大鼠脂代谢、氧化应激和炎性反应的影响探讨解食物毒可能是通过减轻氧化应激损伤，减轻炎症反应，从而具有抗AS功效，可能是其抗AS稳定易损斑块的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性SD大鼠43只，体质量(200±20)g，(由成都达硕实验动物有限公司提供)合格证号：SCK(川)SCXK(川)2015-030。实验前动物适应性饲养一周。高脂饲料配方：2%胆固醇+0.5%胆酸钠+3%猪油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%+维生素D3粉剂(1.25×106IU/kg)喂养。

1.2 主要仪器 InfiniteM200PRO酶标仪：瑞士Tecan公司；LG10-2.4A高速离心机：北京医用离心机厂；HW-80A旋涡混合器：上海精科实业有限公司。电子分析天平，PrecisaXS125A；LG10-2.4A高速离心机，北京医用离心机厂；微量移液器美国ThermoElectron公司。

1.3 药物与试剂 (YJYXF)的制备：解先打(傣百解)20 g，文尚海(百样解)20 g，嘿涛罕(大黄藤)15 g，毫命(姜黄)15 g，蟑螂15 g，咪多领15 g，邓嘿罕(定心藤)15 g，宾蒿(白花臭牡丹)15 g，帕蚌板(三七)5 g，奶子藤10 g，合罕郎跌打(葛根)20 g，管底(三叶蔓荆)10 g，芽害补(野甘草)10 g；将方药用水煎煮、共煎两次，两次水煎液混合后浓缩成稠浸膏至含生药2.4 g/mL，置于-18℃冰箱冷藏备用。辛伐他汀钙片(北京双鹭药有限公司，批号：20181215，规格：10 mg/片)；血脂试剂盒：[总胆固醇(TC)试剂盒(批号：F006-1-1)、甘油三酯(TG)试剂盒(批号：A110-2-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(批号：A113-2-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(批号：A112-2-1)(南京建成生物工程研究所有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(批号：H052-1)、白介素-6(IL-6)试剂盒(批号：H007-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：A001-3-2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号：A005-1-2)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：A003-1-2)、过氧化氨酶(CAT)试剂盒(批号：A007-1-1)。

1.4 造模与分组 选用清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重(200±10)g。清洁级动物房饲养，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3 d，开始试验。采用腹腔注射VD3+高脂饲料(高脂饲料配方：2%胆固醇+0.5%胆酸钠+3%猪油+0.2%丙硫氧嘧啶+94.3%维生素D3粉剂(1.25×106IU/kg)喂养，实验开始时于右下肢肌内注射维生素D3(3×105IU/kg)针剂，每30 d重复1次)喂养9周建立大鼠动脉粥样硬化模型建立食物毒致AS动物模型，随机分5组，每组10只。对照组：Normal；模型组：Normal+腹腔注射VD3+高脂饲料；辛伐他汀组：Normal+腹腔注射VD3+高脂饲料+辛伐他汀(4 mg/kg/d)干预4周；雅解益栽(心)方高剂量组：Normal+腹腔注射VD3+高脂饲料+雅解益栽(心)方(1.4 mg/kg/d)干预9周；雅解益栽(心)方低剂量组：Normal+腹腔注射VD3+高脂饲料+雅解益栽(心)方(0.35 mg/kg/d)干预9周。

1.5 观察指标 血清指标：测定血清中甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，各组主动脉组织中谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氨酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量；测定大鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α含量。

1.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，各组数据均进行正态检验及方差齐性检验，采取方差分析。

2 结果

一般情况各组大鼠体重均明显增加，其中以模型对照组最为明显。YJYXF高剂量组大鼠性情较温顺，精神状态好，毛色光泽，体态匀称，进食水及排尿便正常。模型对照组、低剂量组、辛伐他汀组大鼠性情较暴躁，易撕咬，体态肥胖，便溏，多数大鼠精神不同程度萎靡，运动有所减少，皮毛蓬松而无光泽，其中又以模型对照组更为突出，排便相当。

2.1 雅解益栽(心)方对实验大鼠脂代谢的影响 结果表明(见表1和如图2所示)，与正常组比较，模型组血清TG、大鼠LDL含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，HDL含量无明显变化(P>0.05)，提示动模型建立成功。与模型组比较，YJYXF高低剂量组血清中TG、大鼠LDL含量减少，HDL含量增加，二者差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与阳性药物组比较，高剂量血清TG、HDL含量差异无统计学意义(P>0.01)。表明YJYXF能改善大鼠血脂，在降低TG、升高HDL方面具有优势。详见表1。

表1 各组血清中TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.2 雅解益栽(心)方对实验大鼠抗氧化的影响 雅解益栽(心)方对大鼠血清GSH-Px、SOD和CAT的活性及MDA含量的影响见表2：与空白对照组相比，模型组大鼠血清 SOD、CAT、GSH-PX活性降低，MDA 含量升高，且差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，YJYXF高、低剂量组均能升高 GSH-PX、SOD、CAT 活性，降低 MDA 的含量，且差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表2 各组主动脉组织中GSH-PX、CAT、SOD、MDA的含量水平比较

2.3 雅解益栽(心)方对实验大鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α含量的影响 对AS大鼠血清TNF-α、IL-6的影响见表3：与正常组比较，模型对照组动物血清TNF-α、IL-6含量均显著升高，且差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，YJYXF高剂量组、YJYXF低剂量组与辛伐他汀组TNF-α、IL-6含量均显著下降，且差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 表3 各组鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α含量比较

3 讨论

傣医学是傣族人民在两千多年的生活和医疗实践中形成的以“四塔”“五蕴”为基础理论的核心，“三盘”学说、“雅解”学说为理论特色的一门医学学科。其中，傣医“雅解”理论最具特色，其核心内容包括“未病先解，先解后治，同解同治”及系列“雅解”方药，而解“食物毒”是“雅解”理论的重要组成部分。“雅解”为傣语，意译为解药，指能解除体内各种毒素，平衡和协调“四塔五蕴”以及脏腑功能的一类傣医方药的统称。傣医解“食物毒”历史悠久，傣医药经书和文献中均有记述。如医祖龚麻腊别用文尚海(百样解)解“食物毒”；《阿皮踏麻基干比》《罗格牙坦》《档哈雅龙》等傣族医学文献记载医学大师腊西达菲创立“雅给”方解“食物毒”；傣医学[4- 5]认为，人过食膏粱厚味，尽管它们是人体所必需的营养物质，但过量对人体而言却是一种毒，这种毒傣医学认为是来自于过食食物所产生的毒称为“食物毒”(故采用腹腔注射VD3+高脂饲料喂养建立大鼠动AS模型模仿人过食过食食物而产生的毒)，其可导致机体脏腑功能代谢失调进而内生毒素，在几千年前的傣医经书《嘎牙山哈雅》(人体解说)一书中即有记载，说明傣医学对脏腑及其功能很早就有了较全面的认识。根据书中所述，食物所产生的毒能导致体内“四塔五蕴”功能失调而发病，傣医学中没有“动脉粥样硬化”的病名，但从病因病理和患者的症状方面来看，动脉粥样硬化可归属于傣医的心慌、心悸、胸痛，傣医认为心慌、心悸、胸痛是由于体内塔拢(风、气)不行，留滞胸中，则血运不通，不通则痛；或感受外在的帕雅拢(风邪)，病邪入心，阻滞血脉运行而致。在治疗上，其病位在中上盘，应以先解后治，先服解药，再按上病治上，中病治中的原则分别治以调补中上盘火，除风通气，活血止痛，补火温心，除风止痛和补水清火，养心止痛。

傣医学认为当人体发病后应先服用“解药”，以解除过食食物产生的毒副作用，从而调节人体生理功能，保持体内“四塔”(风、火、水、土)、“五蕴”(色、识、受、想、行)功能的平衡和协调[6]。“雅解益栽(心)方”是从傣医临床文献资料中收集整理的民族有效验方，该方是具有调节体内四塔、五蕴功能，解除人体毒素，保护脏腑功能的解毒方[3]。“雅解益栽(心)方”的药物组成中，雅解先打(傣百解)、文尚海(百样解)性凉，入风、火、水、土塔，调四塔，解酒毒、热毒和其他毒，护脏腑为主药；嘿涛罕(大黄藤)性寒凉，入四塔，有调四塔，解百毒之作用；蟑螂味咸，入土、水塔，有解毒健脾之功；咪多领性溫，补火塔，理气止痛；毫命(姜黄)味苦、微辣，有臭气，性平偏热，入水、土、风塔，具活血止痛，清火解毒之功；管底(三叶蔓荆)根味苦、性凉，入风、水、土塔，清火解毒，治疮疖肿痛等[7-8]。全方合用具有调补四塔、清火解毒之作用，可达调补气血，解热毒、酒毒、食物中毒及保护心肝肾之目的。现代研究[9]表明咪多领具有对伤寒杆菌等较强抗菌作用；蟑螂能在一定程度上调节大鼠溃疡性结肠炎肠道菌群大鼠肠道微生态环境，平衡肠道菌群[10]。前期研究[11-12]表明雅解益栽(心)方对乙硫氨酸引起的小鼠肝脏脂肪蓄积有一定的预防作用，能抑制肝脂中总胆固醇的升高及肝指数的升高，表明其对脂肪输出障碍(脂肪代谢紊乱型脂肪肝)有一定的疗效；对外源性脂质显著增加所致的脂肪肝有一定的预防作用。该实验采用腹腔注射VD3+高脂饲料喂养建立大鼠动脉粥样硬化模型模仿人过食食物而产生的毒(食物毒)，其可导致机体脏腑功能代谢失调进而内生毒素，造模后大鼠血脂水平明显升高。

机体的自由基氧化作用与抗氧化防御作用处于动态平衡状态，平衡状态被打破时就产生了自由基。当自由基的活动超过一定量，就会发生疾病。机体抗氧化酶促系统包括SOD、 GSH-Px、 CAT等。 SOD是酶促防御系的一种重要的氧自由基清除剂，保护细胞免受损伤。CAT是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，过氧化氢它能够对机体造成损害。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，主要清除过氧化氢等自由基，防止脂质过氧化物的生成，起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。MDA是脂质过氧化降解的中间产物，其含量可以反映机体内脂质过氧化的程度，可破坏细胞结构和功能，反映细胞的受损程度。

本研究中YJYXF干预后能显著改善血清中TG、LDL-C、和HDL-C的含量，即YJYXF能够有效改善模型大鼠的脂质代谢水平。给予大鼠高脂饮食联合维生素D3可导致大鼠内皮细胞抗氧化能力下降，血清MDA含量增加、GSH-Px、CAT、SOD活性降低，自由基产生和清除的平衡被破坏，脂质过氧化作用增强，促使形成AS，而MDA、GSH-Px、CAT和SOD是氧化应激反应的标志物之一，能够反映机体的氧化应激状态[13]。YJYXF各剂量组与模型组相比能够有效降低MDA的含量，提升GSH-Px、CAT、SOD的活性，表明YJYXF能够在AS中抑制氧化应激反应。

高水平IL-6都是影响斑块性质稳定性的重要生物学指标。TNF-α可以激活炎症通路而导致内皮细胞损伤，进一步加重AS[13]。实验结果表明，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6的表达水平明显升高，提示TNF-α、IL-6炎性因子在其中起到重要作用。YJYXF干预后，大鼠血清中的IL-6和TNF-α炎性细胞因子水平与辛伐他汀类似，YJYXF各剂量组均可抑制炎性因子的表达，表明YJYXF对大鼠AS炎性反应具有一定的缓解作用。

综上所述，YJYXF能通过调节模型大鼠的脂质代谢水平，降低炎性反应、氧化应激来升高AS大鼠的抗AS能力，降低动脉内皮细胞的脂质过氧化损伤，可改善炎症反应、主动脉病变和稳定斑块，对大鼠AS具有明显的保护作用，其作用机制可能是通过降低动脉内皮细胞的脂质过氧化损伤，减轻炎症反应来解食物毒，从而抑制动脉粥样硬化进程。