滋阴补脾方对人结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用机制研究

武如通 杨思华 史清华 张 芸 黎智燊 郑周杭

(1 广东省第二中医院肿瘤科,广州,510095; 2 广州中医药大学,广州,510006)

结肠癌是常见的国内外恶性肿瘤,全球范围内其发病率占恶性肿瘤第3位,且临床调查显示其在我国发病率不断上升,严重影响人们生命质量[1-2]。目前,关于结直肠癌治疗多以手术治疗为主,但尤其症状较为隐匿,大部分患者确诊时已属晚期,错失最佳根治时机,导致治疗及预后不佳[3]。以化疗为主的综合治疗成为结肠癌主要手段,虽可延长患者生存时间,但其不良反应明显,且化疗会导致患者免疫功能下降[4-5]。因此,寻找有效的治疗结肠癌方法具有重要意义。随着中医药深入研究,在恶性肿瘤治疗方面的良好疗效,且可减轻因化疗引起的免疫功能下降和不良反应[6]。本研究探讨滋阴补脾方对人结肠癌裸鼠移植瘤抑制作用及其机制,为治疗结肠癌提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 4周龄BALB/c雌性裸鼠20只,体质量(18±2)g,饲养环境清洁,自由进食进水,室温(25±2)℃,由中国科学院动物实验中心提供,许可证号:SCHK(新)2010-0005;经广东省第二中医院药理实验中心批准(伦理审批号:048583)。细胞:人结肠癌HT29细胞(中国科学院上海生命科学研究院,货号:AW-CCH107)。

1.1.2 药物 氟尿嘧啶(海南桌泰制药有限公司,批号:21071);滋阴补脾方:太子参20 g、黄芪15 g、山药15 g、茯苓10 g、白花蛇舌草20 g,选取DHJ-D1型煎药机煎药30 min后取汁。

1.1.3 试剂与仪器 BCA试剂盒(上海柏丝特生物科技有限公司,货号:23227),CD113抗体、CD116抗体、P53抗体(Abcam公司,英国,货号:ab17、ab19、ab26)。光学显微镜(OLYMPUS公司,日本,型号:Olympus BX50),微量高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司,型号:TG16-W),水平式电泳仪(北京东方仪器厂,型号:GDS7600),电子天平(Satorius公司,日本,型号:BS210S)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与分组 1)模型制备:分别取对数生长期的结肠癌胰酶消化,制备细胞悬液,调整细胞浓度至5×107/mL,将0.2 mL细胞悬液接种于雌性裸鼠背部皮下。接种后的裸鼠自由饮水和进食饲养,记录裸鼠背部移植瘤的生长情况。2)分组:选取接种结肠癌细胞株成瘤细胞在12 d左右且移植瘤平均直径为5 mm左右的荷瘤裸鼠20只,按照随机数字表法分随机为对照组、化疗药物组、中成药组和联合用药组,每组5只。

1.2.2 给药方法 对照组每只裸鼠上午及下午分别注射等量生理盐水,连续应用4 d,至第14天处死动物;化疗药物组每只裸鼠上午腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午注射生理盐水,1次/d,连续应用4 d,至第14天处死动物;中成药组每只裸鼠上午腹腔注射生理盐水,下午灌胃煮好的中药汤剂10 mL/只(给药相当于临床用药30倍,2.5 g/L剂量给药),1次/d,连续应用4 d,至第14天处死动物;联合用药组:每只裸鼠腹腔注射氟尿嘧啶10 mg/只,下午灌食煎煮好的中药10 mL/只,1次/d,连续应用4 d,至第14天处死动物收集标本。

1.2.3 检测指标与方法 1)肿瘤重量和肿瘤体积测定:给药期间动态观察裸鼠背部肿瘤生长情况,隔日用游标卡尺测量移植瘤最大径(a)及最小径(b),实验第14天颈椎脱位处死实验动物,解剖出裸鼠移植瘤,电子天平沉重,测量肿瘤重量和肿瘤体积,肿瘤体积=ab2/2,抑瘤率=对照组平均体积-处理组平均体积/对照组平均体积×100%。2)蛋白印迹法测定CD113、CD116和P53蛋白表达:取瘤体组织,加入蛋白裂解液充分裂解,提取总蛋白,蛋白总量采用BCA法测定。取蛋白80 μg加入上样缓冲液,煮沸变性5 min,将其迅速低温冷却后加样,进行琼脂糖凝胶电泳。切取含目的蛋白条带的胶块转膜处理及采用含0.5%(v/v)吐温20的Tris缓冲液(Tris Buffered Saline Containing 0.5%(v/v) Tween 20,TBST冲洗后,加入封闭液,放置于4 ℃孵育过夜;采用TBST冲洗,加入二抗,放置于室温条件下孵育1 h;再采用TBST冲洗,凝胶成像仪曝光并显色,测定条带光密度值。

2 结果

2.1 各组肿瘤重量比较 与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合用药组肿瘤重量明显降低(P<0.05);化疗药物组和联合用药组肿瘤重量低于中成药组(P<0.05);联合用药组肿瘤重量低于化疗药物组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肿瘤重量比较

2.2 各组肿瘤体积比较 与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合用药组肿瘤体积明显降低(P<0.05);化疗药物组和联合用药组肿瘤体积低于中成药组(P<0.05);联合用药组肿瘤体积低于化疗药物组(P<0.05)。见表2和图1。

图1 各组肿瘤大小比较

表2 各组肿瘤体积比较

2.3 各组肿瘤体积抑瘤率比较 与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合用药组肿瘤体积抑瘤率明显升高(P<0.05);化疗药物组和联合用药组肿瘤体积抑瘤率高于中成药组(P<0.05);联合用药组肿瘤体积抑瘤率高于化疗药物组(P<0.05)。见表3。

表3 各组肿瘤体积抑瘤率比较

2.4 各组CD113、CD116和P53表达比较 与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合药物组CD113和CD116表达与前面不同下降,而P53表达升高(P<0.05);化疗药物组和联合用药组CD113和CD116表达低于中成药组,而P53表达高于中成药组(P<0.05);联合用药组CD113和CD116表达低于化疗药物组,而P53表达高于化疗药物组(P<0.05)。见表4和图2。

图2 各组CD113、CD116和P53表达

表4 各组CD113、CD116和P53表达比较

3 讨论

目前,结肠癌仍以手术为主要治疗方法,但其术后转移率和复发率均较高,尤其是针对中晚期结肠癌患者,采用手术治疗效果不理想,故而多依赖于化学治疗[7-9]。但化学治疗虽可延长结肠癌患者生存时间,但其不良反应明显[10-13]。

中医认为结肠癌属“肠覃”“肠风”“肠毒”“滞下”“积聚”等范畴,隋·巢元方《诸病源候论》提出积聚病机在于“阴阳不和,脏腑虚弱,受于风邪,搏于脏腑之气所为也”。巢元方更详细描述:“癥者,由寒温失节,致脏腑之气虚弱,而食饮不消,聚结在内,染渐生长,块段盘牢而不移动者,是症也,言其形状,可征验也。”《医宗金鉴》亦对其病因相关论述“积聚、癥瘕、肠覃之疾,皆得之于喜怒不节而伤脏,饮食过饱而伤腑,肠胃填满,汁液外溢,为外寒所袭,与内气血食物凝结相成也”。中医认为结肠癌发病多因先天不足、外邪侵袭、情志内伤、饮食不节、正气虚弱等因素,正气亏虚,脾胃运化失司,湿毒内生,气化无力,郁久化热,肠腑不同,湿热毒邪蕴结肠腑[14-16];或因恣食生冷,寒湿滞肠,均可导致湿热蕴毒、脾失健运下迫结肠,毒聚成痈,腑气不通而致结肠癌[17-18]。滋阴健脾方中,太子参具有益气生津、健脾养胃、气阴双补功效;黄芪具有健脾益气固表功效;山药具有益气养阴、补脾肺肾功效;茯苓具有利水消肿、渗湿健脾功效;白花蛇舌草具有清热解毒、利湿通淋功效。纵观全方可奏滋阴健脾功效。现代药理研究表明,滋阴补脾法可增强机体免疫功能,改善物质代谢,增强造血功能,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,具有明显抗肿瘤作用。本研究表明,与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合用药组肿瘤重量和肿瘤体积明显降低、肿瘤体积抑瘤率明显升高,且联合用药组肿瘤重量和肿瘤体积低于化疗药物组和中成药组而肿瘤体积抑瘤率高于化疗药物组和中成药组,由此可见滋阴补脾法可明显降低肿瘤重量和肿瘤体积,提高抑瘤率。

P53是一种肿瘤抑制蛋白,可通过介导细胞信号转导将应激信号传入细胞,同时还可作为转录因子促进下游目的基因的转录,实现长期或短暂阻滞细胞周期分化、DNA复制与修复,从而达到阻止癌细胞早期增殖的目的,发挥促细胞凋亡作用[19-21]。肿瘤主要是由异质性细胞构成,而其中肿瘤细胞克隆分化与干细胞尤为相似。研究报道显示,由于肿瘤干细胞为肿瘤起始细胞,可维持肿瘤的分化,具有异质、增殖及浸润特性。故肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发转移及发生发展的根源,对其高度表达的标志物研究尤为重要。而CD类因子作为肿瘤干细胞标志物,评价CD类因子表达与恶性肿瘤相关性具有重要意义。而目前,尚无有关CD113和CD116与肿瘤方面报道,缺乏可靠参考依据。本研究表明,与对照组比较,化疗药物组、中成药组和联合药物组CD113和CD116表达下降而P53表达升高,且联合用药组CD113和CD116表达低于化疗药物组和中成药组,而P53表达高于化疗药物组和中成药组,由此可见滋阴补脾法可通过下调CD113和CD116表达及上调P53表达,抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述,滋阴补脾法可抑制人结肠癌裸鼠移植瘤生长,认为其作用机制可能与下调CD113和CD116表达及上调P53表达有关。

利益冲突声明:无。