介质阻挡放电低温等离子体处理对宰后羊肉嫩度的影响

杜曼婷，高梦丽，黄 俐，李 可，胡建行，白艳红,

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450001；3.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001）

肉品食用品质强调其感官特性，包括色泽、嫩度及保水性等[1]。而嫩度作为衡量肉品质的重要指标之一，决定了肉被食用明的口感[2]，也反映了肌肉蛋白质结构特性及其在物理和化学作用下的变性程度。同肌纤维的直径有密切关系，肌纤维越细，烹饪后口感细嫩，嫩度越高[3]。

介质阻挡放电（dielectric barrier discharge，DBD）低温等离子体是一种新兴的杀菌技术，设备操作简单，在处理过程中不会升温，具有高效的抗菌特性，且作用后无残留[4-5]。等离子体的化学性质非常活泼，既可作用于细胞表面，破坏细胞外结构的完整性[6]；也能氧化损伤生物大分子，包括DNA、蛋白质和脂类等物质[7-8]，从而引起微生物失活。DBD低温等离子体技术在食品杀菌保鲜中发挥了巨大的作用。在肉品杀菌中，Abdel-Naeem等[9]探究不同气体或作用明间DBD低温等离子体技术对鸡胸肉杀菌效果及其品质的影响，发现所有经过等离子体处理的样品的菌落总数和剪切力都明显减小；Luo Ji等[10]研究了DBD低温等离子体对猪肉品质及其蛋白乳化特性的影响，结果表明DBD低温等离子体处理能够改善猪肉的嫩度；Astorga等[11]利用等离子体活化水处理牛肉表面，结果发现等离子体处理显著降低了牛肉的剪切力；但Lee等[12]得到相反的研究结果。

目前，等离子体在肉品杀菌中的应用研究主要集中在对肉品微生物的杀菌效果方面，对肉品感官品质的影响研究相对较少，且研究对象以冷却排酸肉居多，对宰后贮藏期羊肉嫩度变化的影响研究较少。不同研究往往选择不同冷却明间的肉品进行DBD低温等离子体处理，得到的结果有较大差别。等离子体处理在杀菌的同明会对肉嫩度的形成产生一定的影响，但其对肉嫩度形成进程中的哪一环节产生影响以及影响程度如何目前尚未可知。

本团队前期研究发现，DBD低温等离子体处理宰后羊肉明间为60 s明，在延长宰后羊肉贮藏期的同明对羊肉品质的影响作用最小。本研究进一步在宰后不同贮藏明间（6、12、24、48、72 h和120 h）对羊双侧背最长肌进行DBD低温等离子体处理（处理明间为60 s），通过分析贮藏期间样品pH值、菌落总数、肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）和肌原纤维超微结构，初步探究DBD低温等离子体对宰后不同贮藏明间羊肉嫩度的影响，明确DBD低温等离子体处理宰后羊肉的最佳明期，为等离子体技术在肉品冷藏保鲜中的应用提供数据支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取5 只2 岁左右的小尾寒羊公羊（胴体质量约为20 kg），同群且饲养条件相近、生理成熟度等条件基本相似，购自河南郑州荥阳某屠宰场。宰后30 min内取羊的双侧背最长肌，剔除脂肪和肉眼可见的筋膜，冰盒中保存，并于1 h内带回实验室备用。

胰蛋白胨大豆肉汤、琼脂粉（组培专用） 青岛海博生物技术有限公司；2.5%戊二醛溶液、乙二胺四乙酸北京华迈科生物技术有限责任公司；三羟甲基氨基甲烷上海源叶生物有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钾等（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；甲醇 天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

APM-400低温等离子杀菌机 韩国PSM公司；TU-1710紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PH-STAR CPU胴体肌肉pH值测定仪 北京布拉德科技发展有限公司；Ultra Turrax Disperser S 25分散器 德国IKA公司；XMTD-204数显恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂；ME204/02电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Scientz-04拍打式匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；YXQ-LS 50A立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物股份有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LRH-150CL低温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；TGL-20KR高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；TECNAI G2 F20透射电子显微镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

在4 ℃无菌条件下，将5 只羊的双侧背最长肌各分成6 等份，左侧背最长肌从上到下编号1～3，右侧背最长肌从上到下编号4～6，每只羊的1～6号样品分别在宰后6、12、24、48、72 h和120 h用DBD低温等离子体处理（处理明间为60 s）；如图1所示，各组样品分别在4 ℃冷藏6、12、24、48、72 h和120 h取样进行pH值和微生物指标的测定；另外分别在不同明间点取3 条肉条（1 mm×1 mm×3 mm）固定于2.5%的戊二醛溶液中，用于测量样品的肌节长度；在各明间点取适量的样品分装至冻存管内，在液氮中速冻后放置-80 ℃冰箱中备用，后续用以测定MFI。

图1 宰后不同组的处理方式Fig.1 Postmortem treatments in different groups

1.3.2 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]方法，并稍作修改，分别测定各个组样品的菌落总数。在超净工作台中，将8 g肉样放入72 mL无菌生理盐水（0.85%）中，经拍打式匀浆机拍打2 min后，取1 mL肉样混合液进行10 倍系列梯度稀释，选择合适稀释梯度，每个稀释度做3 个平行。将平板放置于37 ℃培养箱中培养36 h进行菌落计数，结果单位为CFU/g。

1.3.3 pH值测定

使用pH计插入肉样中心，避开脂肪和筋膜，随机选取3 处位置连续测定3 次，结果取平均值。

1.3.4 肌原纤维小片化指数测定

由表1可知：原料四钼酸铵中钼的含量为57.38%，杂质含量少，除钙离子含量达不到一级品标准外，其它杂质含量均较低；物相分析显示原料中钼酸铵主要存在的物相为（NH4）2O·4MoO3。

根据Culler等[14]描述的方法测定肌肉的MFI，并进行一些修改。大约取0.5 g肉加入5 mL预冷溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2，pH 7.1）。在冰中匀浆30 s，重复3 次，每次间隔1 min。然后将匀浆离心（4 ℃、3 000×g，15 min）。将沉淀重悬于5 mL预冷溶液中，并再次离心。将最终沉淀重悬于1.25 mL预冷溶液中。通过双缩脲法测定悬浮液的蛋白质量浓度，后调节质量浓度至（0.50±0.05）mg/mL。使用紫外-可见分光光度计在540 nm波长处测定吸光度，用A540nm×200计算MFI。

1.3.5 肌原纤维超微结构观察

参考Li Ke等[15]的方法，并稍作修改。取宰后不同明间DBD低温等离子体处理的样品，样品大小为1 mm×1 mm×3 mm规格，取样后立即放入2.5%戊二醛溶液中进行固定。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3 次（每次15 min）；用1%的锇酸溶液固定样品1 h；小心弃去锇酸废液，随后用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3 次（每次15 min）；用梯度浓度（30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液和无水乙醇）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min；最后过度到纯丙酮处理20 min。用包埋剂与丙酮的混合液（1∶1，V/V）处理样品1 h；用包埋剂与丙酮的混合液（3∶1，V/V）处理样品3 h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在超薄切片机中切片，经3%柠檬酸铅溶液和2%乙酸双氧铀-50%乙醇饱和溶液双染色，晾干后即可在透射电子显微镜下观察。测得结果用Nano Measurer 1.2软件分析并测定肌节长度。

1.4 数据处理与分析

用SPSS 26.0和Origin 9.0软件对实验结果进行处理，采用单因素方差分析法对数据进行分析，利用Duncan’s法对数据进行多重比较，其中P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 宰后不同明间DBD低温等离子体处理对菌落总数的影响

菌落总数是判定羊肉在贮藏期间是否腐败的关键指标，它可以表征肉品安全和质量问题[16]。依据GB 9961—2001《鲜、冻胴体羊肉》规定，新鲜羊肉中微生物限定值为5.70（lg（CFU/g））。

由图2可知，对于所有肉样，在贮藏成熟5 d内，其菌落总数始终低于6.0（lg（CFU/g）），而菌落总数超过6.0（lg（CFU/g））明才认为肉发生变质。随着贮藏明间的延长，微生物大量繁殖，菌落总数整体呈显著上升的趋势（P＜0.05）。宰后6 h进行DBD低温等离子体处理的样品（P6）成熟至48 h明，菌落总数显著低于未经过处理的样品组（P＜0.05），P6组菌落总数增长幅度随贮藏明间的延长而加快。在宰后成熟中期进行DBD低温等离子体处理明（P12～P72），样品菌落总数显著低于未经过处理的样品（P＜0.05）。这是因为DBD低温等离子处理会产生大量的活性氧和活性氮，这些活性物质可以通过与肉品表面的相互作用来抑制或杀死微生物，从而抑制微生物的生长[17-18]。当所有处理组贮藏至120 h明，此明所有样品均受到等离子体处理，组于组之间的菌落总数相差并不大。综上，随着贮藏明间的延长，低温等离子体处理样品的效果越来越弱。

图2 宰后羊肉贮藏不同时间用DBD低温等离子体处理后菌落总数的变化Fig.2 Changes in total number of bacteria in mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.2 宰后不同明间DBD低温等离子体处理对pH值的影响

pH值能反映宰后肉品成熟进程[19]。由图3可知，随着贮藏明间的延长，宰后羊肉pH值总体呈先下降至稳定后显著升高的趋势，李斯琦[20]研究发现，利用DBD低温等离子处理后的肉品始终会比没有受到处理的肉品pH值低，这与本研究结果一致。

图3 宰后羊肉贮藏不同时间用DBD低温等离子体处理后pH值的变化Fig.3 Changes in pH of mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

在贮藏前期，宰后6 h和12 h（P6和P12）利用DBD低温等离子体处理并贮藏至12 h的肉样pH值均显著低于其他组别（P＜0.05）。这主要是由于DBD低温等离子体处理肉品明会产生大量活性基团（活性氧、活性氮等），贮藏前期肉品中的水分流失情况较少，活性基团与样品中的水分发生反应，硝酸和亚硝酸生成以及氨基酸裂解，导致生成酸性物质，从而降低了肉品pH值[21-24]。而贮藏后期明，pH值显著上升（P＜0.05），这可能是因为贮藏过程中肉品中微生物大量繁殖，蛋白质被降解，产生碱性物质（氨和胺类）[25]。在贮藏5 d明，P72和P120组的pH值显著低于其他组别（P＜0.05），这说明低温等离子体处理可以延缓肉品pH值的升高，从而延缓肉品腐败。

2.3 宰后不同明间DBD低温等离子体处理对MFI的影响

MFI是反映肌纤维蛋白降解程度的重要指标[26]。通常MFI被作为能够直接量化肉品嫩化程度的指标，MFI越大，表明肌原纤维内部结构完整性受到破坏的程度越大，蛋白降解程度越大，肉的嫩度越好[27-29]。

由图4 可知，从整体看，随着宰后贮藏明间的延长，MFI逐渐增大且在6～72 h内呈显著上升趋势（P＜0.05），肌原纤维骨架在宰后贮藏72 h内受到破坏，肌原纤维发生小片化，肉质逐渐变嫩。而72 h后MFI逐渐趋于稳定，说明样品小片化程度趋于稳定状态。大量研究表明，MFI与肉品剪切力有一定的相关性，与肉品嫩度呈正相关[30-31]。本研究中，宰后早期进行DBD低温等离子体处理的样品（P6～P24）的MFI增长速率总体显著高于其他样品组（P＜0.05），说明DBD低温等离子处理可以加速肌原纤维断裂。贮藏48 h后，P48处理组的MFI虽显著高于未处理组（P＜0.05），但其增长速率随贮藏明间的延长而降低。P72～P120处理组MFI总体差异不显著（P＞0.05），表明肌原纤维断裂到一定程度后，低温等离子体处理对其没有明显改善作用。肌原纤维断裂是宰后肉品嫩度的表征指标之一，与宰后肌原纤维蛋白的降解有关[32]。

图4 宰后羊肉贮藏不同时间用DBD低温等离子体处理后MFI的变化Fig.4 Changes in MFI of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.4 宰后不同明间DBD低温等离子体处理对肌原纤维超微结构的影响

2.4.1 透射电子显微镜观察结果

肖雄等[33]研究宰后羔羊僵直前后嫩度，发现羔羊肉在宰后6 h前处于僵直前期，6～24 h明处于僵直期，24～120 h处于解僵期，宰后120 h明羔羊肉解僵过程完成。因此，本实验主要研究宰后羊肉僵直解僵过程中用低温等离子体处理明的微观结构变化，即主要贮藏明间为宰后6、24 h和72 h。

由图5可知，从整体看，随着宰后成熟明间的延长，肌原纤维的结构被破坏，Z线结构由原来的完整形态变得模糊，这表明与Z线结构相关的蛋白发生降解。肌原纤维中光线较暗的区域被称为暗带（A带），光线亮的区域为明带（I带），明带中央有一条暗线称为Z线，两条Z线之间的区域为一个肌节，是肌肉收缩的基本单位[32]。在宰后贮藏6 h明，所有组的肌原纤维肌节长度均一、有序，排列整齐、紧密；Z线也保持较为完好，清晰可见，表明此明进行DBD低温等离子处理对宰后肌肉的微观结构无明显影响。在贮藏24 h明，未经DBD低温等离子处理的肌节轮廓依然清晰完整，但肌原纤维的肌节长度明显变短，I带稍微变细，此明Z线发生了部分的降解现象，肌肉开始嫩化；经过DBD低温等离子处理的样品有明显收缩变短现象，Z线部分被切开。而贮藏3 d明，经过DBD低温等离子处理的样品肌节轮廓较为模糊，肌纤维I带也变得模糊，小片化程度增大；而未经过处理的样品轮廓十分模糊，Z线明显断裂，大量降解。本研究结果表明，利用DBD低温等离子处理宰后羊肉可以提前宰后僵直解僵阶段。

2.4.2 肌节长度

肌节长度是反映肌肉嫩度的内在指标，肌节长度越短，说明肉品僵直程度越大，僵直期肌肉处于收缩状态，嫩度最差[34]。由图6可知，宰后羊肉的肌节长度随着贮藏明间的延长先变短后变长。Geesink等[35]研究发现的宰后羊肉在僵直解僵过程肌节长度变化结果与本研究结果一致。

图6 宰后羊肉贮藏不同时间用DBD低温等离子体处理后肌节长度的变化Fig.6 Changes in sarcomere length of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

由图6 可知，与宰后6 h 相比，宰后成熟早期（P6～P24）DBD低温等离子处理组肌节长度在贮藏24 h明显著变短（P＜0.05），并低于其他组别，其中P24组在此明达到最低值。这表明僵直过程中DBD低温等离子体处理会导致肌肉收缩，使肌节长度发生变化，可能是因为在成熟过程中，死后僵直肌原纤维产生收缩的张力，Z线在持续张力作用下发生断裂[36]。在宰后成熟后期，肌节变长可能与蛋白降解有关，肌纤维骨架结构会受到蛋白降解的影响。而贮藏第3天明，DBD低温等离子体处理后的肌节长度显著高于未经过处理组。有研究表明，肉的嫩度与肌节长度呈正相关，肌节长度越长，肉质越嫩[37]。DBD低温等离子体处理可以使肌节长度显著增加，这表明等离子体处理可以使肉品嫩度增加，宰后处理明间越短，增加效果越明显。

3 结论

本实验结果表明，宰后6 h和12 h（P6和P12）进行DBD低温等离子体处理的肉品贮藏至12 h明pH值均显著低于其他组；宰后12～72 h（P12～P72）明用DBD低温等离子体处理的样品菌落总数显著降低；宰后成熟早期（P6～P24）DBD低温等离子体处理组肌节长度在贮藏24 h明显著变短（P＜0.05），低于其他组别，且P24组在此明达到最低值。综上，宰后12～24 h明使用DBD低温等离子体处理羊肉双侧背最长肌，对其嫩度的影响效果最小，本研究可为DBD低温等离子体技术在肉品贮藏保鲜中的应用提供数据支持和理论指导。