宰后猪背最长肌踝蛋白降解与汁液流失率的关系

杨汝男,李燕清,陈 韬

(云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201)

我国猪肉产量和猪肉消费量均居世界首位[1],目前市场上销售的猪肉主要分为热鲜肉,冷鲜肉和冷冻肉。相较于热鲜肉和冷冻肉,冷鲜肉在营养价值、口味、外观包装和食品卫生等方面都更有优势[2]。冷鲜肉的食用质量指标主要包括滋味、质地、多汁性和气味等,其中持水性(WHC)是评价鲜肉与肉制品品质的重要指标之一,持水性的大小经常用汁液流失率来描述[3],它直接关系到冷鲜肉的成品率,嫩度和风味[4]。近年来研究发现,肌肉骨架蛋白的降解对汁液流失率和冷鲜肉的嫩度也有重要影响[5-6]。

踝蛋白(分子量225 kDa)是一种重要的肌肉细胞骨架蛋白质,踝蛋白作为细胞骨架肌动蛋白结合蛋白，在膜蛋白与细胞骨架结构的偶连及信号通路中起到了非常重要的作用[7]。Koohmaraie等[8]研究发现，肉品成熟嫩化的主要原因是肌原纤维蛋白质的变化和网状结构的消失。这些变化包括组成细胞膜骨架的蛋白质踝蛋白以及肌原纤维中高分子量蛋白质肌联蛋白、伴肌动蛋白等的降解。Kristensen等[9]和Melody等[10]研究发现，踝蛋白(talin)宰后第一天开始降解,最早可在宰后24～48 h观测到。Kristensen等[11]发现宰后成熟过程中,踝蛋白发生快速降解,使骨骼肌膜结构遭到破坏,使肌纤维收缩时产生的交联及肌原纤维之间的交联断裂,挤压细胞内水分的力被消除,使肌肉的持水能力提高,因此推测持水性的增加是骨架蛋白质的降解使肌细胞横向膨胀的结果。Huff-Lonergan等[11]研究发现,踝蛋白的降解能减少肌肉的汁液流失率。但Schäfer等[12]在研究宰后3～24 h踝蛋白的变化与汁液流失的关系时,观察到在宰后早期踝蛋白的降解与汁液流失无关。可见,宰后猪肌肉踝蛋白的降解与持水性的关系还存在争议。

因此，本文利用蛋白质印迹技术对宰后猪肉正常肉与PSE肉的踝蛋白变化与持水性的关系进行研究,旨在探索影响肉持水性的内在因素,对揭示冷却肉的汁液流失形成机理具有重要的理论和学术价值,对指导我国迅速发展的冷却肉生产,具有重要经济意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大河乌猪 云南东恒集团;甲醇 洛阳市化学试剂厂;冰醋酸 广东汕头西陇化工厂;氯化钠 天津市瑞金特化学品有限公司;氯化钾 天津市瑞金特化学品有限公司;盐酸 北京化工厂;磷酸氢二钠 天津市瑞金特化学品有限公司;磷酸二氢钾 天津市瑞金特化学品有限公司;结晶牛血清蛋白 Sigma公司;二巯基乙醇Amresco公司;SDS十二烷基磺酸钠 Amresco公司;Tris-碱 Amresco公司;甲叉双丙烯酰胺 Amresco公司;过硫酸胺(APS)Amresco公司;甘氨酸 上海生工;甘油 Amresco公司;TEMED Amresco公司;以上试剂均为分析纯;丙烯酰胺 超级纯,Amresco公司。

HC-3018R台式高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;HI9025C便携式pH计 意大利哈纳;CR-400/410色差仪 日本美能达;T25-Basc高速匀浆机 德国IKA;BioRadPowerPac通用电泳仪电源 伯乐生命医学有限公司;BioRad小型垂直电泳系统 伯乐生命医学有限公司;BioRad槽式转印系统 伯乐生命医学有限公司;凝胶扫描仪 精工爱普生公司;全自动酶标仪 北京普朗新技术有限公司;HH-6恒温水浴锅 常州市华普达教学有限公司;CP-先行者电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;XW-80A漩涡混合器 云南科仪化玻有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 选择饲养条件相同的40只平均重量大约为140 kg的大河乌猪，在屠宰场中进行屠宰,屠宰后获得40条背最长肌,将背最长肌切分成20 cm×15 cm×10 cm的肉样作为测定样品。从中选取10个看起来可能为正常肉样(RFN)和10个最可能为PSE肉样,测定汁液流失率后依据Warner等[13]的标准(PSE肉:L*>50,汁液流失率>5%,pH<6.0 RFN肉L*=42～50,汁液流失率<5%,pH<6.0)得到15个RFN肉样和5个PSE肉样。

1.2.2 肉色的测定 取宰后45 min和0～4 ℃冷藏24 h的RFN和PSE肉样测定肉色,测定时取背最长肌肉样,然后切成体积为8 cm3的肉块,将肉样新切的一面在空气中暴露10 min后,用便携式色差仪测定L*值、a*值和b*值。每一肉样测定三次,取平均值作为该肉样的L*值、a*值和b*值。

1.2.3 pH和温度的测定 取宰后各时间点(45 min、3、9、12、24 h)的RFN和PSE背最长肌肉样用便捷式pH计测定pH和温度,将探头插入肉样中,使pH计电极与肌肉组织充分接触,待pH计稳定后记录pH和温度。

1.2.4 汁液流失率(drop loss rate)的测定 采用Honikel法[14],取宰后24 h的背最长肌肉样,然后切成体积为8cm3的肉块称重W1,置于保鲜袋中,冲气(肉样不能和保鲜袋接触),在4 ℃下掉挂24 h,取出称重W2,两次重量之差除以初重W1的百分数即为汁液流失率。

1.2.5 踝蛋白的降解

1.2.5.1 SDS-PAGE电泳蛋白样品的提取 SDS-PAGE电泳蛋白样品的提取采用全肌肉蛋白提取的方法,参照Huff-Lonergan等[15]的方法。称取0.8 g切碎的背最长肌肉样,加入10 mL的全肌肉蛋白提取液(10 mmol/L磷酸钠,pH7.0,2%(w/v)SDS),匀浆(6500 r/min,4 ℃,30 s),在20 ℃下离心15 min(1500 g),取上清液,用BCA法测蛋白上清液浓度。上清液蛋白均用双蒸水调节蛋白浓度至6.4 mg/mL。

取1 mL调整好浓度的蛋白上清液与0.5 mL样品缓冲液(30 mmol/L Tris-HC1,3 mmol/L EDTA,3% SDS溶液,30%甘油,0.002%溴酚蓝(0.003%焦宁),pH8.0)混合并加入0.1 mL 2-巯基乙醇,置于50 ℃水浴加热20 min,冷却至室温后放入-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2.5.2 踝蛋白的SDS-PAGE电泳及蛋白质印迹 参照Bee等[16]方法,制胶厚度0.75 mm,分离胶浓度为6%,浓缩胶浓度为5%。从左至右依次加入预染Mark 5 μL、参比蛋白样品(选用宰后45 min,汁液流失率最小的12号正常肉样,汁液流失率=0.96%)和宰后各时间点(45 min、3、9、12、24 h)蛋白样品上样量均为25 μg。样品通过浓缩胶时设定电压60 V,待样品进去分离胶后调整电压到120 V。

SDS-PAGE电泳结束后进行转模,转模条件为电压90 V,时间1 h。待转模结束后,取出PVDF膜，将其放于5%的脱脂奶粉中封闭2 h，结束后进行一抗的孵育,孵育条件为4 ℃过夜,结束后取出PVDF膜,在室温下进行洗膜,洗膜条件为使用TBST在摇床上洗膜三次,每次时间10 min。结束后,进行二抗孵育,孵育条件为室温下孵育1 h。孵育结束后,进行洗膜(TBST洗三次,每次时间10 min),将洗净后的膜经辣根过氧化酶(HRP)标记的ECL化学发光试剂显影,并于暗室中曝光。试验过程中,选用的一抗为鼠抗(Anti-talin antibody produced in mouse,clone 8D4),稀释比例为1∶200,二抗为抗鼠(HRP-Goat anti-Mouse IgG(H+L),SA00001-1),稀释比例为1∶8000。

1.2.5.3 目标蛋白定量 曝光后的胶片经EPSON凝胶扫描仪扫描,用Image-Pro Plus软件分析宰后45 min、3、9、12与24 h目标蛋白光密度值,参比蛋白光密度值。目标蛋白的光密度值与参比蛋白光密度值的比值作为该目标蛋白的相对光密度值,用以表示目标蛋白的降解程度,目标蛋白的相对光密度值越低则表示蛋白的降解度就越高,反之亦然。每张胶片重复定量三次求平均值,以提高数据的准确度。

1.2.6 宰后pH、温度、踝蛋白相对光密度值与汁液流失率的相关性 对宰后各时间点(45 min、3、9、12与24 h)RFN肉样与PSE肉样的pH、温度、踝蛋白的相对光密度值与宰后24 h两种肉样的汁液流失率进行相关性分析。

1.2.7 宰后pH、温度与踝蛋白相对光密度值的相关性 选用20个肉样(包括15个RFN和5个PSE)，对宰后各时间点(45 min、3、9、12与24 h)RFN肉样与PSE肉样的pH、温度与宰后各时间点(45 min、3、9、12与24 h)两种肉样踝蛋白的相对光密度值进行相关性分析。

1.3 数据统计分析

使用Excel 2007计算数值;Image-Pro Plus 6.0进行图片分析;SPSS 18.0软件进行独立样品t检验和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 宰后肉色的变化

宰后45 min和24 h两组肉样肉色指标如表1所示,宰后45 min与24 h时,正常肉的L*、a*、b*值均低于PSE肉。其中PSE组的L*显著高于正常组(p<0.05)。

表1 宰后肉色的指标Table 1 Meat coloring of pork during postmortem

猪肉的色泽主要是受肌红蛋白的数量及存在状态、光线反射、水分、氧化程度等因素的影响[17]。根据肉色不仅可以鉴别肉的新鲜度,还可以辨别PSE肉、DFD肉等劣质肉。PSE肉颜色苍白,一方面由于肌红蛋白含量相对较低,另一方面与肌红蛋白的化学变化有关。pH下降的速度和程度对肉色有一定的影响。肌肉pH下降过快可能会造成包括肌红蛋白在内的肌浆蛋白在高温、低pH条件下发生变性,肌肉的持水性降低、肉色灰白,即产生PSE肉[18-19]。

2.2 宰后肌肉pH的变化

宰后两种肉样的pH变化如图1所示,在宰后45 min和3 h,正常肉的pH显著高于PSE肉(p<0.05),而在之后的测定时间点(9、12、24 h)，两种肉样的pH无显著差异(p>0.05)。正常肉在宰后9 h内pH快速下降,以后下降速度变缓。宰后9～12 h之间,PSE肉的pH几乎不下降,12 h之后pH显著下降(p<0.05)。

图1 宰后肌肉pH的变化Fig.1 Changes of pH during postmortem注:a、b、c、d表示同组内含相同字母差异不显著(p>0.05),含不同字母差异显著(p<0.05);*表示不同组间同一时间点差异显著(p<0.05)；图2～图4同。

猪肉宰后45 min的 pH一般为6.1～6.4[20]。本实验中,正常肉与PSE肉的pH都随贮藏时间的延长而下降,正常肉宰后45 min时的pH在5.8～5.9之间,可能与猪的品种，肉样的取样量有关;PSE肉宰后45 min时的pH在5.6左右,显著低于正常肉(p<0.05),说明通过宰后45 min的pH可初步辨别PSE肉。猪肉的pH下降到5.4左右时便不会再下降,这是由于肌肉过低的酸度会使肌糖原无氧酵解过程中的酶被抑制而失活,酸性物质也随之停止产生,这时的pH达到了宰后最低值,被称为极限pH[21]。本实验中,正常肉宰后24 h约为5.6,其未到达极限pH,PSE肉的最低pH出现在宰后24 h,约为5.5,由于肉样的种类与数量存在不同,所以与马莉等[20]研究结果略有差异。

2.3 宰后肌肉温度的变化

宰后各时间点,正常肉样的温度均低于PSE肉样。宰后45 min和3 h,PSE肉的温度显著高于正常肉的温度(p<0.05),而在之后的测定时间点(9、12、24 h)两种肉样的温度无显著差异(p>0.05)。正常肉样组在宰后45 min与3、12、24 h之间温度存在显著差异(p<0.05),宰后9～12 h之间,温度无显著差异(p>0.05)。PSE肉样组在宰后45 min与3、9、12 h与24 h之间，温度存在显著差异(p<0.05),宰后9 h到12 h之间,温度无显著差异(p>0.05)。

刚屠宰的猪温度大概在38.3～41.7 ℃间,宰后24 h温度降至3.4 ℃左右,与本实验的结果基本一致。此外,宰后45 min的温度同样可以像宰后45 min的pH一样准确的预测汁液流失,其原因是宰后45 min的温度影响着宰后45 min的pH变化。因为宰后肌肉温度下降时,导致代谢酶的活力也下降,从而减缓了宰后肌肉的代谢速率,降低了pH的下降速率,提高了肉的保水性[22]。

图2 宰后肌肉温度的变化Fig.2 Changes of temperature during postmortem

2.4 不同肉样的汁液流失率

宰后第24 h的两组肉样的汁液流失率如图3所示,两组肉样的汁液流失率存在显著差异(p<0.05)。PSE肉的汁液流失率比正常肉高62.65%。

图3 宰后24 h正常肉与PSE肉的汁液流失率Fig.3 After 24 h drip loss in RFN and PSE pork注:*表示组间差异显著(p<0.05)。

猪肉在分割、储藏过程汁液流失率范围可达2%～10%之间。Wu等[23]研究表明，宰后第24 h，PSE肉的汁液流失率比正常肉高75.22%。

2.5 踝蛋白的降解

2.5.1 宰后踝蛋白降解情况 如图4所示,宰后两组肉样的踝蛋白相对光密度值都随时间的延长而逐渐降低,即踝蛋白随时间的延长逐渐降解。其中,正常肉样组的踝蛋白相对光密度值在宰后45 min与3、9、12、24 h之间均存在显著差异(p<0.05),9 h与12 h之间无显著差异(p>0.05);PSE肉样组的踝蛋白相对光密度值在宰后45 min～9 h无显著差异(p>0.05),9 h到24 h之间存在显著差异(p<0.05)。宰后9 h正常肉样与PSE肉样的踝蛋白相对光密度值差异显著(p<0.05),而在其余的测定时间点(45 min、3、12、24 h)两种肉样的踝蛋白的相对光密度值无显著差异(p>0.05)。

图4 正常肉与PSE肉踝蛋白的降解Fig.4 Talin degradation in RFN and PSE

踝蛋白对肌细胞维持特定形态以及系水力都起着重要的作用[24],中间丝能够将相邻肌原纤维连接起来,踝蛋白是组成中间丝结构的主要蛋白质[25]。如果中间丝结构在僵直过程中保持完整,僵直产生的力通过踝蛋白传递到整个细胞，使细胞体积减小,肌细胞间隙变大,导致汁液流失的产生。Kristensen等[9]研究发现,宰后第1 d踝蛋白开始降解,第4 d踝蛋白降解了68%。Tomisaka等[26]研究了宰后肌肉系水力的变化,发现踝蛋白在宰后第4 d降解为最初的25%。本实验中,正常肉样与PSE肉样的踝蛋白在宰后45 min开始降解,正常肉样组和PSE肉样组的踝蛋白在宰后24 h分别降解了70.10%和66.66%,降解速度与Kristensen等[9]、Tomisaka等[26]研究结果相比加快。

2.5.2 踝蛋白的western-blot结果 Wu等[23]、陈韬等[27]研究表明,经SDS-PAGE电泳得到的踝蛋白的条带位置位于180～245 kDa中间,因此在此位置进行抗体孵育并进行显影分析,得到图5踝蛋白的western-blot结果,根据试验结果可观察踝蛋白的降解情况。

由图5可看出,PSE肉样组的蛋白条带颜色较浅,说明PSE肉样组在宰后各时间点的踝蛋白相对光密度值均比正常肉样组在宰后各时间点的踝蛋白相对光密度值低,则可判断出PSE肉样降解速度更快。

图5 踝蛋白的蛋白质印迹结果图Fig.5 Western Blot patterns of Talin in RFN and PSE

2.6 宰后pH、温度、踝蛋白相对光密度值与汁液流失率的相关性

2.6.1 宰后pH、温度与汁液流失率的相关性 由表2可见,宰后各时间点(45 min、3、9、12、24 h)的pH与汁液流失率均呈负相关,其中,宰后45 min和24 h的pH与汁液流失率呈显著负相关,这与Lonergan等[28]研究一致。有研究发现,宰后24 h的pH与宰后肌肉的持水性、色泽,感官品质有关,也与肌肉中蛋白质的变性及降解程度有关。宰后肌肉酸度过高会导致持水力下降[29],本试验中PSE肉的pH始终低于正常肉,且pH与汁液流失率之间呈显著负相关,说明宰后低pH会导致高汁液流失率。

表2 宰后肌肉pH、温度与汁液流失率的相关性(N=19)Table 2 Correlation between pH,temperature、relative and drip loss of pork during postmortem(N=19)

宰后各时间点(45 min、3、9、12与24 h)的温度与汁液流失率均呈正相关,其中,宰后45 min与3 h的温度与汁液流失率呈显著正相关。说明宰后早期高温会降低肌肉持水性,这与的Schäfer等[12]研究报道结果一致。

2.6.2 宰后肌肉踝蛋白相对光密度值与汁液流失率的相关性 由表3所示,宰后45 min、3、9、24 h的踝蛋白的相对光密度值与汁液流失率呈正相关,说明宰后45 min、3、9、24 h的踝蛋白相对光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越小;宰后12 h的踝蛋白平均光密度值与汁液流失率呈负相关,说明宰后12 h时,踝蛋白相对光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越大,但宰后各时间点的踝蛋白的相对光密度值与汁液流失率均无显著相关性。这与Annettte Schafer等[12]报道的结果一致,即宰后早期(3～24 h)踝蛋白的降解与汁液流失无关。但有研究表明踝蛋白的完整度在宰后2、3、5 d与持水性呈显著正相关，且踝蛋白降解使肌肉的持水性增强。

表3 宰后踝蛋白的相对光密度值与汁液流失率的相关性(N=19)Table 3 Correlation between relative optical density of Talin and drip loss of pork during postmortem(N=19)

2.7 宰后pH、温度与踝蛋白相对光密度值的相关性

由表4所示,宰后各时间点(45 min、3、9、12、24 h)pH与宰后45 min、3、9、12 h踝蛋白的相对光密度值均呈正相关,其中宰后45 min的pH与宰后45 min的踝蛋白相对光密度值呈显著正相关;宰后12 h的pH与宰后9 h的踝蛋白相对光密度值呈显著正相关,说明宰后pH越低,踝蛋白的相对光密度值越低,降解程度越高,汁液流失率越小,踝蛋白的持水性越强;宰后45 min与24 h的pH与宰后24 h的踝蛋白相对光密度值呈负相关且无显著相关性,说明宰后pH越低,踝蛋白的相对光密度值越高,降解程度越低。

表4 宰后踝蛋白的相对光密度值与pH,温度的相关性(N=19)Table 4 Correlation between relative optical density of Talin and pH,temperature of pork at postmortem(N=19)

有研究发现,极限pH与肌肉中蛋白质的变性及降解程度有关[30]。本实验中,初始pH与踝蛋白的降解程度呈显著负相关;极限pH与踝蛋白降解程度呈正相关且无显著相关性,说明极限pH与蛋白质降解程度无关。由于所选肉样的种类不同且宰后测定时间点不同,所以与Giuseppe Bee等[29]研究结果有差异。

3 结论

宰后正常组的pH高于PSE组,但温度却低于PSE组,说明宰后肌肉pH和温度联合变化,肌肉的高酸度(低pH)和高温引起了肌肉持水性的降低。据此可以推断,宰后由于在高温和低pH的共同作用,PSE肉的持水性大大降低。此外,宰后早期低pH是导致PSE肉的产生的重要因素。

宰后两组肉样的踝蛋白都随着贮藏时间的推移而降解,正常肉样的踝蛋白降解程度低于PSE肉样组的踝蛋白降解程度,宰后各时间点(45 min、3、9、12 h)踝蛋白的相对光密度值与汁液流失率呈不显著正相关(p>0.05)。说明PSE肉样的踝蛋白降解速度更快,踝蛋白的降解不可以减少猪肉的汁液流失率,对持水性无影响。