miR-30a 在胃肠道间质瘤中的表达及其调控细胞增殖、侵袭和凋亡的机制

任 华 马 明 王 超 王昭君

1.山西省大同市第五人民医院普外科，山西大同 037000；2.山西医科大学生理学系，山西晋中 030600

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是最普遍的肉瘤类型，约占全部胃肠道肿瘤的0.2%，多发于50 岁以上人群[1]。资料显示，GIST 的发生率在不同地区和人群中有所差异，以中国、韩国及挪威发病率最高[2-3]。GIST 可并发呕吐、消化道出血等症，严重时可诱发消化道梗阻及穿孔，导致严重腹部疼痛及感染，危及生命健康。现阶段，GIST 治疗方式主要包括手术切除和靶向药物治疗，其中伊马替尼是目前不可切除性原发性及转移复发性GIST 的一线治疗药物，但并非所有患者均对其敏感，且部分患者存在耐药问题，导致预后不甚理想[4-5]。寻找新的治疗策略是目前GIST 领域的重要课题。微RNA-30（microRNA-30，miR-30）a 是广泛表达于人体各种组织中的一种miRNA，在多种肿瘤中发挥抑制或促进的作用[6-8]。miR-30 家族中的其他成员也在GIST 中发挥着重要的调节作用，如miR-30c 可以通过靶向基因来抑制GIST 细胞的增殖和迁移，表明miR-30 家族是在GIST 发展和治疗中具有潜在价值的生物标志物和药物靶点[9]。然而，目前关于其在GIST 中的作用及相关机制报道尚少。研究miR-30a 在GIST 中的作用和机制，有助于揭示GIST 的发病机制，寻找新的治疗靶点和策略。本研究采用脂质体转染法转染miR-30a 基因过表达质粒、沉默质粒至GIST-T1 细胞中，检测细胞行为学变化，并分析可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021 年11 月至2022 年11 月在山西省大同市第五人民医院进行手术切除治疗的GIST 患者30 例，男19 例，女11 例；年龄51～72 岁，平均（65.61±9.53）岁。所选受试者均通过病理学检查证实为GIST，排除术前放化疗或药物治疗者。选取患者手术切除的正常组织（距离GIST 组织边缘＞5 cm）作为对照，经手术切除的GIST 组织、正常组织均投入液氮保存。本研究经山西省大同市第五人民医院伦理委员会批准（2021-030），患者或家属对研究内容知情同意。

1.2 细胞株

人GIST-T1 细胞株购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.3 药物、主要试剂、仪器

miR-30a NC、mimics、inhibitor 质粒，大连华医基因生物技术有限公司构建；LipofectamineTM3000 试剂盒（货号：R0084-100ML，常州三友生物工程有限公司）；双萤光素酶检测试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（货号：E1910、A5001，美国Promega公司）；MTT 试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC 液（货号：M6494、A35109、A13199，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（货号：A120227，长春新兴药业集团有限责任公司）；兔抗人转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、Smad2、p-Smad2 一抗（货号：ab92486、ab40855、ab53100，美国Abcam 公司）。Transwell 小室（美国康宁公司）；SpectraMax 酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；Attunenxt 流式细胞仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.4 qRT-PCR 法检测GIST 组织及正常组织中miR-30a 表达量

取液氮中保存组织，充分粉碎，提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳或者比色分析等方法鉴定RNA 纯度与完整性。将提取的总RNA 采用stem-loop 法逆转录成cDNA，逆转录温度为16～18℃，时间30 min。设计miR-30a 和内参基因的qPCR 引物序列，miR-30a：正向为5’-GCGTCACGTGCCCGCGCATCCGAC-3’；反向为5’-GCGACTGTACGTGTCACCGACT-3’；U6：正向为5’-CTGCACGTGCTGCTCAA-3’；反向为5’-GAGGTAAC-GTGCAGTGTGTG-3’。用qRT-PCR 试剂盒，将cDNA 混合物进行荧光定量PCR 分析。通过qPCR数据分析软件对实验结果进行计算和比较，2-△△Ct法计算miR-30a 相对表达量。

1.5 细胞培养、转染及分组

将GIST-T1 细胞株培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640 培养基中，标准条件下培养箱内常规培养，隔天换液，贴壁后胰酶消化传代，对数期细胞用于后续实验。调整细胞密度为1×106个/ml，接种于6 孔板，待细胞生长至贴壁，分别将miR-30a阴性对照质粒miR-30a NC、过表达量质粒miR-30a mimics、沉默质粒miR-30a inhibitor 转染至GIST-T1细胞，分别设为miR-30a NC 组、miR-30a mimics 组、miR-30a inhibitor 组，另取对数期GIST-T1 细胞设为对照组，培养24 h 用于后续实验。

1.6 qRT-PCR 检测miR-30a 表达量

取各组细胞，操作同“1.4”。

1.7 MTT 法检测增殖能力

取各组细胞，预冷PBS 漂洗、重悬，分别种植于96 孔板中，每孔5 000 个细胞，在完全培养液中培养24、48、72 h 后分别加入新制备的MTT 溶液（5.00 g/L，20 μl），孵育4 h，弃上清并加入150 μl DMSO，充分振荡至甲瓒晶体溶解，检测490 nm 波长处各组细胞增殖率，细胞增殖率=（实验组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%，其中空白组为不含细胞和待测物质的培养基和MTT溶液。

1.8 Transwell 实验检测细胞侵袭能力

Matrigel 基质凝胶融化后涂抹至Transwell 小室，取各组细胞加入无血清培养液调节细胞密度至1×106个/ml，取200 μl 各组细胞悬液加入Transwell 小室上层，下层中加入完全培养液趋化，置于37℃、5%CO2标准环境恒温培养箱中孵育24 h，用棉签去除上层腔中未通过Matrigel 基底膜的细胞，用甲醇固定通过细胞，并用0.1%结晶紫染色，在显微镜下随机选择5 个不重复视野，计算侵袭染色细胞数/视野数。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组细胞，清洗、重悬，调整细胞密度为1×105个/ml 接种至6 孔板，加入完全培养液培养2 d，PBS 清洗两次，低温离心2 min（3 500 r/min，半径为8 cm），吸弃上清，按照凋亡试剂盒说明书要求进行后续实验过程，binding buffer 液重悬细胞，Annexin V-FITC 液染色后，再加入PI 液二次染色，遮光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算各组凋亡率。

1.10 Western blot 法检测细胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表达量

取各组细胞，充分裂解，低温10 000 r/min 离心10 min，取上清并定量蛋白。取少量样本蛋白，混合4倍量上样缓冲液，水浴加热变性蛋白，按照每孔20～30 μg 的量加载到凝胶槽中，加入预染色蛋白作为分子量标准，用恒压电源进行电泳分离；将分离好的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上，用转印仪或半干法进行转印；将转印好的膜用5%牛奶在室温或4℃封闭1～2 h，防止非特异性结合；将封闭好的膜用含有适当稀释比例的TGF-β1、Smad2、p-Smad2 一抗溶液在4℃过夜或室温2 h 孵育，使一抗与目标蛋白结合；将孵育好的膜用含有Tween-20 的TBST 缓冲液洗涤3次，10 min/次，去除未结合的一抗；将洗涤好的膜用含有适当稀释比例的荧光标记的二抗溶液在室温1 h孵育，使二抗与一抗结合；洗涤：重复上述洗涤步骤，去除未结合的二抗；将洗涤好的膜用荧光成像仪进行扫描和分析，根据荧光信号的强度和分子量判断目标蛋白的表达水平。

1.11 双萤光素酶实验验证miR-30a 靶向基因

经TargetScan 预测，miR-30a 与TGF-β1 3’UTR存在结合位点，由百通生物科技（天津）有限责任公司鉴定。构建合成野生型TGF-β1 3’-UTR-WT 及突变型TGF-β1 3’-UTR-MUT 载体，与miR-30a 质粒（miR-30a mimics、miR-30a NC）共同转染至293T 细胞，48 h后收集细胞，加入火鲨鱼萤光素酶底物使报告基因发出荧光信号，记录该酶的荧光强度，加入停止缓冲液，停止萤光素酶反应，加入Renilla 萤光素酶底物使内参基因产生萤光，记录该酶的荧光强度。计算出对应的相对荧光单位。相对萤光素酶活性=火鲨鱼萤光素酶活性/Renilla 萤光素酶活性。

1.12 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GIST 组织及正常组织中miR-30a 表达量比较

与正常组织比较，GIST 组织中的miR-30a 表达量降低（P＜0.05）。见表1。

表1 GIST 组织及正常组织中miR-30a 表达量比较（±s）

表1 GIST 组织及正常组织中miR-30a 表达量比较（±s）

注GIST：胃肠道间质瘤；miR-30a：微RNA-30a。

2.2 各组细胞miR-30a 表达量比较

miR-30a NC 组细胞miR-30a 表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，miR-30a mimics 组miR-30a 表达量升高，miR-30a inhibitor 组miR-30a 表达量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞miR-30a 表达量比较（±s）

表2 各组细胞miR-30a 表达量比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05。miR-30a：微RNA-30a。

2.3 各组细胞增殖能力比较

miR-30a NC 组24、48、72 h 细胞增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，miR-30a mimics 组24、48、72 h 细胞增殖率降低，miR-30a inhibitor 组24、48、72 h 细胞增殖率升高（P＜0.05）；与24 h 比较，miR-30a mimics 组、miR-30a inhibitor 组48、72 h 细胞增殖率升高（P＜0.05）；与48 h比较，miR-30a mimics组、miR-30a inhibitor 组72 h 细胞增殖率升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞培养24、48、72 h 后细胞增殖率比较（%，±s）

表3 各组细胞培养24、48、72 h 后细胞增殖率比较（%，±s）

注 与对照组同期比较，aP＜0.05；与本组24 h 比较，bP＜0.05；与本组48 h 比较，cP＜0.05。

2.4 各组侵袭能力比较

对照组、miR-30a NC 组、miR-30a mimics 组、miR-30a inhibitor 组穿膜染色细胞数分别为（70.40±12.48）、（71.20±13.26）、（29.20±5.26）、（96.40±13.59）个/视野。miR-30a NC 组穿膜染色细胞数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，miR-30a mimics 组穿膜染色细胞数减少（P＜0.001）；miR-30a inhibitor 组穿膜细胞数增加（P＜0.001）。见图1。

图1 Transwell 实验检测细胞侵袭能力（400×）

2.5 各组细胞凋亡率比较

miR-30a NC 组细胞凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，miR-138-5p mimics 组凋亡率升高，miR-30a inhibitor 组凋亡率降低（P＜0.05）。见图2、表4。

图2 细胞凋亡率流式图（n=5）

表4 各组细胞凋亡率比较（%，±s）

表4 各组细胞凋亡率比较（%，±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05。

2.6 各组细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2 蛋白表达量比较

图3 各组细胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2 蛋白表达条带图

miR-30a NC 组TGF-β1、p-Smad2/Smad2 蛋 白表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，miR-30a mimics 组TGF-β1 蛋白表达量、p-Smad2/Smad2 降低，miR-30a inhibitor 组TGF-β1蛋白表达量、p-Smad2/Smad2 升高（P＜0.05）。见图3、表5。

表5 各组细胞TGF-β1 蛋白表达量、p-Smad2/Smad2 比较（±s）

表5 各组细胞TGF-β1 蛋白表达量、p-Smad2/Smad2 比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05。TGF-β1：转化生长因子β1。

2.7 双萤光素酶实验结果

miR-30a 与TGF-β1 存在互补序列，见图4。与miR-30a NC 组比较，miR-30a mimics 组TGF-β1-WT荧光酶活性降低（P＜0.05），对突变型TGF-β1-MUT荧光酶活性无影响（P＞0.05）。见图4、表6。

图4 miR-30a 与TGF-β1 互补序列

表6 两组荧光酶活性比较（±s）

表6 两组荧光酶活性比较（±s）

注TGF-β1：转化生长因子β1。

3 讨论

GIST 是一种起源于胃肠道壁内的间叶组织的肿瘤，通常表现为良性或低度恶性，但有时也表现为高度恶性[10]。年龄及家族性GIST 综合征、神经纤维瘤病、Carney-Stratakis 综合征等也会增加GIST 的发生风险[11-12]。其发病机制主要与KIT 及PDGFRA 基因突变有关，突变基因可编码酪氨酸激酶受体，在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用[13-14]。正常情况下，酪氨酸激酶受体只有结合相应配体后才会被激活，从而调节细胞功能，但当KIT 或PDGFRA 基因发生突变时，会导致受体失去对配体的依赖性，持续维持激活状态，从而促进细胞无限制增殖及存活，形成肿瘤。高增殖、高侵袭及低凋亡性是GIST 发生及进展的主要原因，探寻抑制GIST 细胞增殖、侵袭并促进其凋亡的有效方式是治疗该病的关键。

本研究结果显示，GIST 组织miR-30a 表达量低于正常组织，通过转染发现miR-30a mimics 组24、48、72 h 增殖率降低，穿膜染色细胞数减少，凋亡率升高，miR-30a inhibitor 组反之，提示miR-30a 在GIST组织中表达降低，上调其表达可抑制GIST 细胞增殖、侵袭，并促进其凋亡。miRNA 是一非编码小分子RNA，近年来多项研究表明其在GIST 的发病中起重要作用[15-17]。miR-30a 是一种长度为70 个核苷酸的发夹状结构，位于人类第6 号染色体的6q13 区域，主要由MIR30A-1 和MIR30A-2 两个转录本产生，由Drosha 酶在细胞核内切割而成被转运到细胞质中，由Dicer 酶进一步切割为成熟的miR-30a。目前关于miR-30a 与肿瘤关系的研究较多。如Ren 等[18]发现，在透明细胞肾组织和细胞中，miR-30a 明显下调，与晚期TNM 分期和预后不良相关，且表现出有效的抗肿瘤特性。Cai 等[19]认为，在顺铂化疗后卵巢癌患者血清以及顺铂耐药细胞中，miR-30a 的表达显著降低，其过表达可抑制顺铂诱导的自噬并促进耐药细胞凋亡。关于miR-30a 在GIST 中的作用，有研究报道显示其在GIST 中水平较低，并且与伊马替尼的敏感性呈正相关，并被证实是一种伊马替尼敏化剂，为克服该病的化疗耐药性提供了新的希望，提示miR-30a 可能与该病的发生及化疗敏感性有关[20]。

TGF-β/Smad2 信号通路是一种在细胞内发挥多种功能的信号转导途径，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡、细胞稳态及其他细胞功能[21-23]。TGF-β 是机体内常见的一种分泌性细胞因子，作为一组多功能性多肽，其家族中以TGF-β1 活性最高，可被整连蛋白复合物激活，与TGF-β2 受体结合后磷酸化TGF-β1 受体的胞内区域，磷酸化TGF-β1 受体又进一步磷酸化Smad2 蛋白，使其与Smad4 蛋白结合，形成Smad2/4复合物，后者转运到细胞核内与其他转录因子或辅助因子相互作用，调节下游基因表达。既往研究发现，TGF-β 信号通路在肿瘤中被激活，且与miRNA 具有一定关联，具体表现为诱导上皮间质转化，使肿瘤细胞获得更强的迁移和侵袭能力，促进肿瘤转移；刺激血管生成，为肿瘤提供充足的营养和氧气，促进肿瘤生长；抑制免疫系统的抗肿瘤反应，使肿瘤细胞逃避免疫监视和清除；调节基因组稳定性，促进染色体不稳定性和微卫星不稳定性，导致基因突变和表达异常[24-26]。本研究结果显示，上调miR-30a 表达可抑制TGF-β 信号通路蛋白表达，且TGF-β1 是miR-30a的一个靶基因，提示miR-30a 可能通过靶向调控TGF-β 信号通路参与GIST 细胞生物学行为的调控。

综上所述，miR-30a 在GIST 中表达降低，提高其表达可能通过靶向抑制TGF-β 信号通路活性抑制GIST 细胞增殖、侵袭，促进其凋亡。