基于AMPK-GLUT4 轴探讨桑叶生物碱对妊娠糖尿病小鼠糖耐量异常及胰岛素抵抗的作用机制研究

乔艳华 白章莹 王俊芳 李晓敏 田 莹

1.河北省邯郸市妇幼保健院保健科，河北邯郸 056000；2.河北省邯郸市妇幼保健院产科，河北邯郸 056000；3.河北省邯郸市妇幼保健院检验科，河北邯郸 056000；4.河北省邯郸市妇幼保健院儿科，河北邯郸 056000；5.河北工程大学附属医院妇产科，河北邯郸 056001

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期一种常见并发症，在妊娠期首次发现或出现糖代谢异常，其中胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是GDM 重要特征，IR 与葡萄糖和脂质代谢调节异常密不可分[1]。目前，临床治疗GDM 主要方法为日常生活饮食、运动干预和胰岛素注射等，由于治疗效果差且长期服用降糖药物存在潜在的副作用，故不适合GDM 治疗。中药能有效改善IR，桑叶作为治疗糖尿病常用药物之一，因其能减缓IR 作用引起众多学者关注[2]。桑叶富含人体必需氨基酸，还包括多糖、黄酮、生物碱类等活性成分，具有抑菌、降血糖、抑制肿瘤、缓解炎症、抗氧化等作用[3-5]。桑叶生物碱是从桑叶中提取的活性成分，具有降血糖、改善动物肾损伤、氧化损伤等药理作用[6-7]。本实验以GDM 小鼠为研究对象，分析桑叶生物碱对小鼠糖耐量异常及IR 作用，旨在发掘桑叶生物碱在GDM 治疗中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6 雌性小鼠60 只和雄性小鼠30只，体重（20±3）g，6 周龄，购于上海南方模式生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（沪）2021-0010，合格证号：SCXK（沪）2021-0010，购入后保持室内温度（23±2）℃，空气湿度（50±5）%，光照昼夜交替12 h，适应性饲养1 周。本研究经河北省邯郸市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.2 药物、主要试剂和仪器

桑叶生物碱（生产批号：19130-96-2，纯度：98%）购于陕西斯诺特生物技术有限公司；二甲双胍（生产批号：100664-202106）购于中美上海施贵宝制药有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（货号：S8050）购于北京Solarbio 公司；C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）（货号：DG-Elisa）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）[货号：YY（bio）-elisa-012145]酶联免疫吸附试验试剂盒购于美国R＆D 公司；蛋白BCA试剂盒（货号：BCA1-1KT）购于美国Sigma 公司；兔抗鼠腺苷酸蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化腺苷酸蛋白激酶（p-hosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单抗、葡萄糖转运体4（glucose transporters 4，GLUT4）多抗、羊抗兔二抗-HRP 购于英国Abeam 公司；80W-Mini-protean tetra 电泳仪、XCell ⅡBlot Module 小型转印模块垂直电泳槽购于美国SatanCruz 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 建模、分组 按照随机数字表法取50 只处于发情期雌性小鼠，高糖脂饮食喂养6 周后与25 只雄性小鼠同笼过夜，次日，显微镜观察雌性小鼠出现精子或黏液栓现象，即妊娠成功，记为妊娠第1 天，取受孕成功45 只雌性小鼠（5 只未受孕），妊娠5 d 后禁食12 h，腹腔注射35 mg/kg STZ 溶液，诱导GDM 模型[8]。造模后，禁食12 h，小鼠尾部取血，测其空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；25%葡萄糖1 ml 灌胃，2 h 后于小鼠尾部采血，测其2 h 餐后血糖（2-hour postprandial blood glucose，2hPBG），若7.8 mmol/L≤2hPBG＜11.1 mmol/L 且持续1 周即造模成功[9]。

取建模成功的40 只小鼠依据随机数字表法分为模型组、桑叶生物碱低剂量组、桑叶生物碱高剂量组、阳性药物组，每组10 只；选余下10 只未参与造模且妊娠成功的雌性小鼠做对照组。

1.3.2 干预方法 建模成功后，依据参考文献[5]的用量，桑叶生物碱低、高剂量组及阳性药物组分别尾静脉注射100、200、100 mg/kg 药物溶液；对照组及模型组给予等体积无菌生理盐水。1 次/d，共计8 周。

1.3.3 口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）给药第7 周进行OGTT，各组小鼠禁食、不禁水12 h，25%葡萄糖溶液（2 g/kg 体重）灌胃后，采用尾部采血方法，测定并记录小鼠0.5、1、2 h的血糖值。

1.3.4 生化指标检测 给药第8 周依次通过血糖仪、全自动分析仪检测小鼠血清FBG 和空腹胰岛素（fasting insulin，FINs），计算胰岛素抵抗指数稳态模型评估法（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR），稳态模型胰岛β 细胞功能指数（homeostasis model assessment-pancreatic β-cell function，HOMA-β）。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINs（μIU/ml）/22.5，HOMA-β=20×FINs（mU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5][10]。

1.3.5 细胞相关因子检测 生化指标检测结束后，酶联免疫吸附试验法检测血清CRP、TNF-α、IL-6 水平。抗体包被过夜（100 μl，37℃、60 min），加样（100 μl，37℃、60 min），添加酶标抗体（100 μl，37℃、60 min），底物液显色（90 μl，37℃、10 min），终止液停止反应（50 μl），酶标仪测450 nm 处吸光度值，根据标准曲线计算CRP、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.6 RT-PCR 检测肝脏组织AMPK、GLUT4 mRNA 表达处死小鼠，取肝脏组织，匀浆，用Trizol 法提取RNA，测纯度及浓度，逆转录得cDNA。反应体系：1.5 μl Taq聚合酶、0.5 μl 正反向引物、4 μl 模板cDNA、13.5 μl ddH20。扩增条件：预变性（95℃，30 s）、变性（95℃，5 s）、退火（59℃，30 s），共40 个循环，加熔解曲线，降温（50℃，30 s）。GAPDH 为内参对照，采用2-△△Ct法，反复多次，取Ct 均值。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot 检测肝脏组织AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白表达 处死小鼠，取肝脏组织，加RIPA 裂解液，离心（6 000 r/min，15 min，离心半径为20 cm）取上清液，蛋白BCA 试剂盒测总蛋白浓度，样品电泳分离（100 V，80 min）、转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶磷酸盐缓冲液封闭2 h，样品与AMPK（1∶200）、p-AMPK（1∶100）、GLUT4（1∶500）一抗4℃过夜孵育，TBST 缓冲液洗膜，加HRP 标记IgG 二抗室温孵育2 h（1∶2 000），洗膜、曝光、显影。Image J 软件测样品及GAPDH 条带灰度值。目标蛋白相对表达水平计算，即目标条带与GAPDH 条带灰度比值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较进行LSD-t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠OGTT 血糖比较

整体分析发现：对照组与模型组血糖时间、组间、交互作用比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组内比较：对照组2 h 血糖低于0.5、1 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组不同时间点血糖两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较：模型组0.5、1、2 h 血糖高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 对照组与模型组不同时间点OGTT 血糖比较（mmol/L，±s）

表2 对照组与模型组不同时间点OGTT 血糖比较（mmol/L，±s）

注 与本组0.5 h 比较，aP＜0.05；与本组1 h 比较，bP＜0.05；与对照组同期比较，cP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量试验。

整体分析发现：模型组与给药组血糖时间、组间、交互作用比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组内比较：桑叶生物碱低、高剂量组不同时间点血糖两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较：桑叶生物碱低、高剂量组0.5、1、2 h 血糖低于模型组；桑叶生物碱高剂量组0.5、1、2 h 血糖低于桑叶生物碱低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 模型组与给药组不同时间点OGTT 血糖水平比较（mmol/L，±s）

表3 模型组与给药组不同时间点OGTT 血糖水平比较（mmol/L，±s）

注：与本组0.5 h 比较，aP<0.05；与本组1 h 比较，bP＜0.05；与模型组同期比较，cP＜0.05；与桑叶生物碱低剂量组同期比较，dP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量试验。

2.2 各组小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比较

模型组HOMA-IR 高于对照组，HOMA-β 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱低、高剂量组HOMA-IR 低于模型组，HOMA-β 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱高剂量组HOMA-IR 低于桑叶生物碱低剂量组，HOMA-β 高于桑叶生物碱低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比较（±s）

表4 各组小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桑叶生物碱低剂量组比较，cP＜0.05。HOMA-IR：胰岛素抵抗指数稳态模型评估法；HOMA-β：稳态模型胰岛β 细胞功能指数。

2.3 各组小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比较

模型组血清CRP、TNF-α、IL-6 水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱低、高剂量组血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱高剂量组血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于桑叶生物碱低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比较（±s）

表5 各组小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桑叶生物碱低剂量组比较，cP＜0.05。CRP：C 反应蛋白；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6。

2.4 各组小鼠肝脏组织AMPK、GLUT4 mRNA 比较

各组肝脏组织AMPK mRNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组肝脏组织GLUT4 mRNA 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱低、高剂量组肝脏组织GLUT4 mRNA 高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桑叶生物碱高剂量组肝脏组织GLUT4 mRNA 高于桑叶生物碱低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 各组小鼠肝脏组织AMPK、GLUT4 mRNA 水平比较（±s）

表6 各组小鼠肝脏组织AMPK、GLUT4 mRNA 水平比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桑叶生物碱低剂量组比较，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖转运体4。

2.5 各组小鼠肝脏组织AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比较

各组肝脏组织AMPK 蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组肝脏组织p-AMPK、GLUT4蛋白水平低于对照组（P＜0.05）；桑叶生物碱低、高剂量组肝脏组织p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于模型组（P＜0.05）；桑叶生物碱高剂量组肝脏组织p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于桑叶生物碱低剂量组（P＜0.05）。见图1、表7。

表7 各组小鼠肝脏组织AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比较（±s）

表7 各组小鼠肝脏组织AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与桑叶生物碱低剂量组比较，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；p-AMPK：磷酸化腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖转运体4。

3 讨论

IR 指胰岛素靶组织对胰岛素敏感性及葡萄糖代谢能力下降，是代谢综合征中心环节[11]。GDM 主要病理生理特征和2 型糖尿病类似，即出现明显IR 现象和胰岛素分泌不足，使得机体糖脂代谢紊乱，氧化应激及炎症反应被异常激活[12-13]。因妊娠晚期机体内激素变化使得胰岛素敏感性减弱，胎盘分泌胰岛素酶促进机体胰岛素降解，进而导致生理性IR；妊娠前机体内已存在IR 的患者，妊娠后期因胎盘分泌拮抗胰岛素的激素增加，致使血糖升高、IR 增强，即病理性IR[14]。

被过度激活的母体炎症及氧化应激反应能影响胰岛素信号传导，引起IR 从而导致糖脂代谢紊乱[15]。炎症在IR 中发挥重要作用。CRP 作为炎症标志物，直接参与炎症过程从而引起IR[16]。本研究结果显示，桑叶生物碱可调控葡萄糖吸收速率，明显提升GDM 小鼠口服葡萄糖耐量；且能有效抑制IR 发生，使血清HOMA-β 水平升高，HOMA-IR、CRP、TNF-α、IL-6 水平降低。提示桑叶生物碱能够修复胰岛细胞功能损伤、调节血糖、改善小鼠糖耐量异常与IR 作用。

参与IR 生物信号传导途径众多，AMPK 是一种代谢主调节剂，与许多代谢疾病密不可分[17]。AMPK即AMP 依赖的蛋白激酶，广泛参与糖、脂肪、蛋白质等多种物质代谢过程，是以IR 为主要病理基础的代谢性疾病临床治疗新靶点[18-19]。GLUT4 是AMPK 通路中胰岛素调节葡萄糖转运蛋白，脂肪组织中GLUT4高表达可增强胰岛素敏感性及葡萄糖耐量；GLUT4通路又在治疗糖尿病中取得新进展[20]。AMPK 可通过诱导GLUT4 向浆膜转移或经其磷酸化后启动GLUT4因子表达。且AMPK 磷酸化后可激活GLUT4 并促进糖代谢[21]。AMPK 在调节糖脂代谢、抑制炎症反应、抗氧化应激、维持线粒体稳态等多方面发挥改善机体IR 的作用[22]。中药提取物基于AMPK 改善IR[23-24]。高迎春等[25]发现，桑叶提取物能够发挥抑制IR 作用，通过介导AMPK 上下游信号通路级联，改善IR。本研究结果显示，桑叶生物碱各剂量组肝脏组织p-AMPK蛋白、GLUT4 mRNA 和蛋白水平均较模型组升高。提示桑叶生物碱可能是通过AMPK-GLUT4 轴调控葡萄糖代谢，降低IR。

综上所述，桑叶生物碱可改善GDM 小鼠炎症反应、调控血糖并抑制IR，其作用机制可能与激活AMPKGLUT4 途径有关。桑叶是药食同源的一种物质，开发桑叶活性功能成分，治疗GDM 有较大的临床应用价值，前景广阔。