前列腺六段跨膜上皮抗原4 对炎症环境下前列腺癌细胞增殖的影响

孙兴华 于 涛 张学新 常鸿艳 洪月光 李伟伟

1.河北省秦皇岛市中医医院肿瘤科，河北秦皇岛 066000；2.潍坊医学院生命科学与技术学院，山东潍坊 261053；3.河北省秦皇岛市中医医院心血管内科，河北秦皇岛 066000；4.河北省秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，河北秦皇岛 066000

前列腺癌是危害全世界男性健康的最常见恶性肿瘤之一[1]。炎症在多种人类肿瘤包括前列腺癌的发生、促进和发展中起重要的作用[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，LPS的识别与跨膜信号转导，是引起细胞炎症效应的关键。有研究显示，长期慢性炎症反应的发生是非小细胞肺癌、胃癌和宫颈癌发生的重要致病因素[3-6]。感染及炎症与前列腺癌的关系密不可分，革兰氏阴性杆菌的反复感染是慢性前列腺炎发病的重要原因，增加了PCa细胞的增殖能力、迁移能力及局部侵袭能力[7-8]。前列腺六段跨膜上皮抗原（six-segment transmembrane epithelial antigen of prostate，STEAP）家族参与多种生物学过程，包括增殖和炎症，在癌症治疗中发挥潜在作用[9]。STEAP4 是STEAP 家族成员之一，参与乳腺癌和膀胱癌的发展，并与结肠癌的炎症有关[10-12]。另有研究表明，STEAP4 在前列腺癌组织中高度表达，并且相关性分析得出STEAP4 高表达的患者比低表达的患者其前列腺癌复发的时间更快，可作为前列腺癌患者的预后指标[13]。然而，STEAP4 在前列腺癌发展中的作用和相关机制仍不清楚。本研究旨在探讨STEAP4 对LPS 诱导的前列腺癌细胞增殖的影响，可能为前列腺癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理

人前列腺癌细胞系PC3（货号：CRL-1435）和VCaP（货号：CRL-2876）由ATCC 提供，并在含有10%胎牛血清（Gibco，美国）和1%青霉素/ 链霉素的DMEM（赛默飞世尔科技公司，中国）中于37℃、5%CO2条件下培养。参照Xu 等[14]研究，将PC3 和VCaP细胞暴露于1 μg/ml 的LPS（索莱宝，北京）中孵育24 h诱导炎症环境。

1.2 细胞转染

采用Lipofectamine 2000（赛默飞世尔科技公司，中国）将沉默载体（si-STEAP4 及其对照si-con）转染进入细胞。经48 h 转染后，观察细胞生长情况，收集细胞用于进一步研究。STEAP4 的siRNA（si-STEAP4：5’-AUCUUACAAGUUUUCUCCAU-3’）和siRNA 阴性对照（si-con：5’-AGACAUGUGUGUGUCCGCCTT-3’）购自GenePharma（上海）。实验重复3 次，设3个复孔。将细胞分为对照组、LPS 处理组、转染对照组（LPS+si-con）和转染沉默组（LPS+si-STEAP4）。

1.3 蛋白免疫印迹

采用放射免疫沉淀法测定蛋白浓度，根据光密度（optical density，OD）值从标准曲线中计算蛋白的浓度。根据蛋白浓度计算上样量。本研究实验的样品量为20 μl，上样量为30 μg。临用前加入最终的样品缓冲液：2%SDS、100 mmol/L DTT、60 mmol/L Tris（pH 6.8）、0.01%溴酚蓝和10%甘油。在电极（正极）上依次叠放PVDF 膜和凝胶。转膜结束，将膜浸入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBS）中缓慢振荡后洗涤。抗STEAP4（cat.No.PA5-106509，1∶1 000 稀释度，赛默飞世尔科技公司）；环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）（cat.No.#A11070，1∶1000 稀释度，赛默飞世尔科技公司）；抗-cGMP 依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）1（cat.No.#3248，1∶1 000 稀释度，Cell Signaling Technology）、抗-PKG2（cat.No.PA5-116863，1∶1 000 稀释度，赛默飞世尔科技公司）、抗血管扩张剂刺激磷酸蛋白（vasodilator stimulated phosphoprotein，VASP）（cat.No.ab109321，1∶1 000 稀释度，Abcam）、抗磷酸化VASP（p-VASP，ab218619，1∶1 000 稀释度，Abcam）、抗β-actin（cat.No.ab8227，1∶2 000 稀释度，Abcam），4℃缓慢振荡过夜；加HRP标记的二抗（1∶12 000 稀释），室温缓慢振荡2 h 后洗涤；以β-action 作为内参，采用Quantity One 软件将条带转化为灰度值，蛋白表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3 次。

1.4 采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞因子的含量

取对数生长期的PC3 和VCaP 细胞，以2×107/L接种于6 孔板中，每孔2 ml，细胞贴壁后按照分组进行处理。用si-con 或si-STEAP4 转染PC3 和VCaP 细胞。转染24 h 后，用1 μg/ml LPS 另外再处理细胞24 h。收集上清液于4℃、4 000 r/min 离心10 min（离心半径10 cm)。按照ELISA 试剂盒白细胞介素（interleukin，IL）-6（cat.No.KHC0061）、IL-8（cat.No.KHC0081）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α)（cat.No.MS223-4）说明书操作，检测上清液中IL-6、IL-8 和TNF-α 含量。实验重复3 次，设3 个复孔。

1.5 CCK-8 法检测细胞存活率

将PC3 和VCaP 细胞（1×104/ 孔）接种至96 孔板。经LPS 处理后，加入10 μl 的CCK-8 试剂（Beyotime）并孵育4 h。使用SpectraMax iD5 微板读取器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）检测450 nm 处的OD 值。实验重复3 次，设3 个复孔。

1.6 EdU 染色

将PC3 和VCaP 细胞（5×105/孔）接种至6 孔板，用si-con 或si-STEAP4 转染PC3 和VCaP 细胞。转染24 h 后，用1 μg/ml LPS 另外再处理细胞24 h。根据操作说明书使用EdU 检测试剂盒（Abcam）进行孵育。使用DAPI（Beyotime）将细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察细胞。细胞增殖以总细胞中EdU 阳性细胞的百分比来表示。实验重复3 次。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 8 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 处理后各组前列腺癌细胞中STEAP4 蛋白表达水平的变化

LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞的STEAP4 蛋白表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞的STEAP4 的表达水平与转染对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染沉默组PC3 和VCaP 细胞的STEAP4 的表达水平显著低于转染对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 LPS 处理后各组细胞中STEAP4 蛋白表达水平的变化（n=3）

2.2 STEAP4 敲除对LPS 诱导的各组前列腺癌细胞的炎症反应的影响

LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LPS 处理组和转染对照组PC3 和VCaP细胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染沉默组PC3 和VCaP 细胞的IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达水平显著低于转染对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 STEAP4 敲除对LPS 诱导的各组前列腺癌细胞的炎症反应的影响（n=3）

2.3 STEAP4 敲除对LPS 诱导的各组前列腺癌细胞增殖的影响

LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞24、48、72 h 的增殖活力显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LPS 处理组和转染对照组PC3 和VCaP 细胞24、48、72 h 的增殖活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染沉默组PC3 和VCaP 细胞24、48、72 h 的增殖活力均低于转染对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞的增殖活力显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；LPS 处理组和转染对照组PC3 和VCaP 细胞的增殖活力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染沉默组PC3 和VCaP 细胞的增殖活力显著低于转染对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 STEAP4 敲除对LPS 诱导的各组前列腺癌细胞增殖的影响（n=3）

2.4 STEAP4 敲低对LPS 诱导的前列腺癌细胞中cGMPPKG 信号途径的影响

LPS 处理组PC3 和VCaP 细胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；转染对照组和LPS处理组PC3 和VCaP 细胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染沉默组的PC3 和VCaP 细胞中cGMP、PKG1、PKG2 和pVASP/VASP 的相对表达量显著高于转染对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 STEAP4 敲低对LPS 诱导的前列腺癌细胞中cGMP-PKG 信号途径的影响（n=3）

3 讨论

前列腺癌是世界范围内男性发病率排名第二的恶性肿瘤[15]。近年研究报道，在前列腺癌组织中能观察到慢性炎症反应，被认为是前列腺癌进展的驱动因素之一[16]。另有研究报道，感染及炎症与前列腺癌的关系是密不可分的，革兰氏阴性杆菌的反复感染是慢性前列腺炎发病的重要原因，并且大量证据表明，感染促进了前列腺癌的发展和转移[17-18]。LPS 作为革兰氏阴性菌的主要化合物，能够激活免疫细胞产生多种细胞因子和后续的炎症反应[19]。有研究显示，LPS 可增加前列腺癌细胞增殖的能力、迁移的能力及局部侵袭的能力，增加了癌细胞的恶性程度[20]。STEAP 家族在前列腺癌中发挥重要作用。既往研究表明，STEAP4 是受炎症细胞因子调节的靶点[21-22]；此外研究表明，在炎症相关环境下STEAP4 在结肠癌的发展中起重要作用[12]。目前，STEAP4 在炎症环境下对前列腺癌发展的影响的相关研究鲜见报道。

本实验采用LPS 诱导前列腺癌模拟炎症环境，结果显示，LPS 处理后的前列腺癌细胞的增殖能力升高，STEAP4 蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。转染si-STEAP4 敲低STEAP4 能够抑制炎症条件下前列腺癌的细胞增殖及炎症因子的水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。另外EdU 染色分析结果显示，LPS 能够促进细胞增殖，而STEAP4 沉默逆转了这一效应。以上结果显示，STEAP4 敲低可减轻LPS 诱导的前列腺癌增殖，提示STEAP4 在前列腺癌治疗中的潜力。

本研究进一步探索了STEAP4 在前列腺癌中介导的下游途径，并发现其可能与cGMP-PKG 信号传导有关。cGMP 参与多个信号转导过程，有研究表明，PKG2 可以抑制许多肿瘤的细胞增殖，如结肠癌、黑色素瘤和卵巢癌[23-25]。既往研究表明，cGMP-PKG 信号的激活有助于减少前列腺癌中的细胞增殖[26]。本研究显示，在LPS 存在的情况下，cGMP-PKG 通路在前列腺癌中失活。本研究仍存在不足，今后仍需要进行体内实验以进一步研究STEAP4 的潜在功能。

综上所述，STEAP4 下调能够抑制LPS 诱导的前列腺癌的增殖。本研究为炎症环境下前列腺癌的进展提供了新的见解，并指出了治疗前列腺癌的潜在靶点。