pre-S基因变异与乙型肝炎病毒感染患者肝功能和肝纤维化的相关性

马苗苗,刘 媛

陕西省西安市第五医院检验科,陕西西安 710082

HBV感染可致使机体肝脏炎症损伤,不及时治疗可导致HBV反复感染,导致患者的肝功能发生难以逆转的损伤,增加肝硬化等不良预后的发生风险[1]。目前HBV感染患者预后的具体影响机制尚未清晰,明确其发生的相关机制对于患者病情的早期控制可能具有积极意义。研究发现,HBV由S区、X区等4个编码区构成,其中S区包括pre-S基因和S基因区,而pre-S基因与HBV复制、侵袭、机体免疫等均具有明显的关系[2]。有研究发现,机体中HBV-DNA极易由于宿主免疫、药物等的影响,在反转录过程中发生变异,其中pre-S基因变异发生率较高[3]。研究认为,pre-S基因变异能够促使HBV免疫逃逸,是导致HBV感染患者病情进展的重要因素[4]。但是目前关于pre-S基因变异与HBV感染患者肝功能和肝脏纤维化指标关系的研究较少。因此,本研究纳入HBV感染患者178例,对此进行了分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年12月至2022年6月本院收治的HBV感染者178例作为研究对象,其中无症状HBV携带患者65例作为对照组,慢性乙型肝炎(CHB)患者70例作为CHB组,乙型肝炎肝硬化患者43例作为肝硬化组。纳入标准:各组均根据《慢性乙型肝炎防治指南:2019版》[5]进行诊断,并符合相关诊断标准;基因型均为HBV C型;HBV-DNA定量检测均≥104IU/mL;均成功获取pre-S基因序列。排除标准:合并丙型肝炎等其他肝脏疾病;有外科手术史;存在精神障碍;患恶性肿瘤;患血液系统疾病;有近6个月抗病毒等相关治疗史;患其他感染性疾病;有药物依赖史;有酗酒史。对照组中男41例、女24例,年龄31～54岁、平均(42.78±5.96)岁。CHB组中男45例、女25例,年龄29～57岁、平均(42.37±5.73)岁。肝硬化组中男27例、女16例,年龄32～56岁、平均(42.49±6.01)岁。3组基础资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究通过本院医学伦理委员会审核(LIB-20230533)。所有患者对本研究均知情同意。

1.2方法 采集3组患者清晨空腹静脉血10 mL,使用美国Beckman AU5821全自动生化分析仪测定肝功能,相关指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白。使用放射免疫法测定肝脏纤维化指标,相关指标包括层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽,试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司,严格根据试剂盒说明书进行操作。

取3组患者血清,使用核酸提取试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司)进行HBV-DNA的提取。将待测HBV-DNA作为模板,使用巢式PCR法对HBV pre-S基因进行扩增。引物设计为IF:5′-ACCWTATWCYTGGGAACAA-3′;IR:5′-GAGAGAAGTCCACCACGAGT-3′;ⅠaF:5′-ACCWTATWCTGGGAACAA-3′;ⅠaR:5′-TTCCACTGCATGGCCTGAGGATGA-3′;ⅠbF:5′-GACTYGTGGACTTCTC-3′;ⅠbR:5′-GGGGTCCTAGGAATCCTGATG-3′。2轮PCR反应体系均为50 μL,其中首轮PCR扩增程序:94 ℃3 min预热,94 ℃30 s变性,根据引物序列的不同使用差异化的退火温度,退火 30 s,延伸72 ℃ 30 s,随后95 ℃30 s开展30个循环,延伸72 ℃ 10 min。取首轮PCR产物作为第2轮PCR的模板,PCR扩增程序同首轮PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确认产物质量,随后使用PCR产物进行纯化,并开展pre-S基因序列的测定。使用Lasergene软件拼接序列,使用GenBank数据库内已知基因型HBV毒株的参考序列与检测序列进行核苷酸序列比对,检测pre-S基因变异情况。其中pre-S基因变异包括缺失变异、T3116m变异、起始密码子变异、T53m变异等,纳入HBV感染患者中频率超过10%的变异进行研究。根据是否发生基因缺失变异,将HBV感染患者分为变异组和非变异组。

1.3观察指标 比较对照组、CHB组、肝硬化组患者的pre-S基因变异情况、肝功能和肝纤维化指标水平。比较变异组和非变异组的肝功能和肝纤维化指标水平。

2 结 果

2.1对照组、CHB组、肝硬化组患者的pre-S基因变异情况比较 对照组和CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、CHB组以及肝硬化组T3116m变异率、起始密码子变异率、T53m变异率以及A3120m变异率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 对照组、CHB组、肝硬化组患者的pre-S基因变异情况比较[n(%)]

2.2对照组、CHB组、肝硬化组患者的肝功能和肝纤维化指标水平比较 对照组和CHB组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于肝硬化组,清蛋白水平明显高于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于CHB组,清蛋白水平明显高于CHB组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对照组、CHB组、肝硬化组患者的肝功能和肝纤维化指标水平比较

2.3变异组和非变异组患者的肝功能和肝纤维化指标水平比较 将43例基因缺失变异患者纳入变异组,135例非基因缺失变异患者纳入非变异组。非变异组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平均明显低于变异组,清蛋白水平明显高于变异组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 变异组和非变异组患者的肝功能和肝纤维化指标水平比较

2.4pre-S基因变异类型与患者肝功能和肝纤维化指标的相关性 pre-S基因缺失变异与ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平均呈正相关(P<0.05),与清蛋白水平呈负相关(P<0.05)。T3116m变异、起始密码子变异、T53m变异、A3120m变异与ALT、AST、清蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平均无相关性(P>0.05)。见表4。

表4 患者肝功能和肝纤维化指标与pre-S基因变异类型的相关性

3 讨 论

HBV属于DNA病毒,其中pre-S基因为HBV基因组中较易发生变异的区域,主要包括pre-S1、pre-S2基因,可通过编码pre-S1、pre-S2等HBV外膜蛋白,参与HBV的复制、侵袭、机体免疫反应等过程[6-7]。pre-S基因变异主要包括缺失、起始密码子突变等类型,能够通过改变病毒复制、机体免疫应答等机制促进HBV感染疾病的进展[8-9]。目前认为,不同地区HBV感染患者的pre-S变异类型具有一定差异,关于pre-S变异类型与HBV感染患者病情的关系尚存在争议[10]。其中pre-S基因缺失变异被认为是预测肝细胞癌发生和术后复发的有效生物标志物[11]。本研究发现,随着HBV感染患者病情的进展,pre-S基因变异率明显提高,尤其是pre-S缺失变异率,这可能是由于pre-S基因的缺失变异能够影响病毒复制、与宿主的结合、免疫应答等生理过程,并可促使乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平增加以及在内质网的累积,使HBV颗粒的合成减少,导致毛玻璃样肝细胞的发生,进而加重肝脏损伤,促使患者病情进展,增加了肝硬化等的发生风险[12]。此外,本研究发现,在HBV感染患者中,除了pre-S基因缺失发生频率较高以外,常见的基因变异还包括起始密码子变异。研究发现,pre-S基因起始密码子变异能够对启动子活性产生抑制作用,使小S蛋白合成受阻,HBsAg合成异常,进而不利于病毒颗粒的装配与释放[13]。但是本研究发现,对照组、CHB组、肝硬化组间起始密码子变异率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。关于起始密码子变异与HBV感染患者病情的关系需纳入更多样本进行深入分析。

ALT、AST、清蛋白是衡量机体肝功能的常用指标,层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽是评估机体肝脏纤维化严重程度的有效指标,在临床中均应用广泛。本研究发现,ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平在对照组、CHB组以及肝硬化组中逐渐增加,清蛋白在对照组、CHB组以及肝硬化组中逐渐降低,提示随着HBV感染患者病情严重程度的增加,肝功能损伤和肝脏纤维化均逐渐加重。这可能是由于HBV感染对肝脏产生炎症刺激,促使肝细胞损伤,进而导致肝功能异常;HBV感染能够增强肝星状细胞活性,导致细胞间基质在肝脏累积,进而促使肝脏纤维化的进展[14]。此外,有研究认为,T3116m为HBV感染患者发生肝硬化的独立影响因素[15],但是本研究中并未见此关联,可能是样本差异所致。关于T3116m与乙型肝炎肝硬化的关系需深入分析。

本研究发现,变异组ALT、AST、清蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平与非变异组比较,均具有明显差异,且HBV感染患者肝功能、肝硬化指标水平与pre-S基因缺失明显相关,进一步提示pre-S基因缺失可能通过改变肝功能、加快肝脏纤维化进程,促进HBV感染病情的进展。这可能是由于pre-S1基因与病毒增殖周期有关,pre-S1基因的缺失可阻碍机体免疫系统对pre-S1蛋白的识别,抑制相应抗体的合成,进而不利于机体对病毒的清除[16-17]。pre-S2基因可通过pre-S2蛋白的表达,减少HBV所致炎症损伤,pre-S2基因表达的缺失可抑制机体免疫反应,加重HBV感染;可阻碍HBV小蛋白等的分泌,促使大球形HBV颗粒表达增加[18-19]。也有研究发现,肝硬化失代偿期患者pre-S基因缺失率明显高于代偿期[20]。关于pre-S基因缺失情况与肝硬化患者病情严重程度的关系仍需进一步分析。

综上所述,pre-S基因缺失变异与HBV感染患者肝功能和肝纤维化指标明显相关。临床中对于pre-S基因缺失的HBV感染患者,应密切关注其肝功能和肝纤维化指标水平的变化,并及时进行对症治疗,以延缓病情进展,改善患者预后。