基于荧光光度法的水中石油类污染物便携原位测定装置研制与应用

巫培山，陈宇萍，2，梁维新*，郭鹏然，雷永乾，潘佳钏

（1.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东广州 510070；2.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529000）

石油类污染物质在我国危险废弃物名录48 种危险物质中排名第8 位［1］，具有持久性、难降解、易积累的特点［2］，其含有的多环芳烃（PAH）如苯并［a］蒽、䓛、苯并［b］荧蒽具有潜在致癌性［3］，可干扰生物的生理功能，影响繁殖、生长和免疫能力，甚至导致生物死亡［4］。同时，石油类物质进入水体后可形成油膜阻碍水体的复氧作用，抑制生物呼吸和影响海洋浮游生物生长，破坏水生态环境平衡，造成严重的生态危害［5］。

目前石油类污染物质的测定方法主要有重量法［6］、气相色谱法［7］、红外分光光度法［8］、紫外分光光度法［9］和荧光分光光度法［10-11］等。其中荧光分光光度法利用石油类污染物中的芳烃组分在紫外光的激发下发射出特定波长的荧光特性进行测定，具有灵敏度高、响应快速、免破坏样品等优势［12］，但上述方法均为实验室检测方法，需从现场采集样品，再通过有机溶剂萃取后测定，因此时间和人力成本较高，且需使用大量有机溶剂，难以实现现场原位、高频率监测及全天候监测，无法及时反映水体真实污染状况。水中石油类污染物的原位、快速分析技术具有实时性强、响应速度快的特点，可通过较高的频率对目标水体进行现场原位监测，实现水中石油类污染数据的实时、连续数据反馈［13］以及监测数据自动化采集和传输，提高水环境智能化监测水平。该方法避免了频繁人工采样和样品处理［14］，降低了整体监测成本，同时减少了人为因素对监测结果的影响，提高数据的可靠性［15］。国外对于水中石油类污染物的原位检测技术起步较早，目前已有较成熟的技术与产品，市占率较高，如HACH 公司的FP360 sc、Turner designs 公司的C3TM等，而国内的同类型仪器起步相对较晚，为此，有必要开展水中石油类污染物的原位快速分析技术研究，为我国水生态环境监测提供技术支持。

本文研制了一种基于荧光光度法的水中石油类污染物原位测定装置，考察了装置检测性能，并对实际样品进行检测。该研发装置具有稳定性好、准确度高、响应速度快的优势，适用于野外环境现场监测、环境事故现场应急检测等领域。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

三维荧光光谱仪（Aqualog®，法国HORIBA Scientific 公司）；原位测油装置（自研）；分析天平（BSA224S-CW，德国赛多利斯公司）。海洋环境监测石油成分分析标准物（以下简称HJ 油标准）（1 000 mg/L，国家海洋环境监测中心）；福尔马肼浑浊度溶液标准物质（4 000 NTU，北京北方伟业计量技术研究院有限公司）；腐殖酸（≥90%）、正己烷（色谱纯），购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）；汽油、柴油、重油、润滑油等石油类标准物质由油品检测服务机构提供。

1.2 标准溶液配制

石油类标准溶液：使用天平分别准确称量0.01 g 的重油、柴油、汽油、润滑油于烧杯中，加入正己烷溶解后转移至25 mL 容量瓶，使用正己烷定容至刻度，得到各石油类污染物的标准储备溶液。使用正己烷将石油类污染物标准储备液稀释至0.5、1、5、10、50、100、500、1 000 mg/L 后作为石油类标准溶液使用，使用三维荧光光谱仪测定。

水中油标准溶液：石油类污染物在水中溶解度较低，过量的油易在水体表面形成油膜，难以形成均匀的水中油溶液。本研究中，通过向高纯水中加入一定量石油类物质，放置一段时间后去除表面油膜，将剩余溶液转移至洁净烧杯中以去除原容器中过量油在容器表面形成的油斑，所得即为均匀稳定的水中油标准溶液。使用正己烷萃取水中油标准溶液，然后采用实验室测定方法测定萃取液中油类物质的浓度，最终得到水中油标准溶液中实际的油类浓度。本文采用常见的水中油类污染物重油、柴油以及润滑油分别配制了3 种水中油标准溶液，其实际质量浓度分别为21.1、20.58、35.25 mg/L，并用于研制的原位测油装置的校准和测试。

1.3 样品测试方法

实验室测试方法：参考文献［11］，使用10 mL 正己烷萃取100 mL 水样中石油类物质后使用三维荧光光谱仪测定其荧光强度，每次测定前润洗比色皿2～3 次。原位测油装置测试方法：无需采集水样和采用有机溶剂进行萃取，根据测定深度将探头浸入水下合适位置，稳定20 s后直接原位测定。

2 结果与讨论

2.1 装置原理与整体设计

石油类污染物中的芳香族化合物和多环化合物受到紫外光激发时，其分子内部的电子会跃迁到一个较高的能级，形成激发态，随后，这些激发态的分子会发生非辐射跃迁返回到基态并释放荧光，其荧光信号强度与浓度呈正相关［16］。因此，可以通过测量荧光强度计算水中石油类污染物的浓度，本工作即基于该原理研制水中石油类污染物的便携式原位测试装置。装置整体采用浸入式探头设计，主要由荧光光路以及数据采集两部分组成，其中荧光光路部分由LED 激发光源、透镜、二向色镜、光电二极管组成，数据采集部分由精密光电转换放大器、数模转换器、下位机、上位机组成，系统的总体设计如图1所示。

图1 原位测油装置整体设计图Fig.1 Design of in-situ oil measurement device

上位机通过控制下位机驱动LED 激发光源发射紫外激发光，待测水样中的石油类污染物在紫外光激发作用下产生荧光；荧光光路中的光电二极管检测荧光强度并转化为电流信号；精密光电转换放大器接收并精确放大来自光电二极管的微弱电流信号，将其转换为模拟电压信号；模数转换器将模拟电压信号转为数字信号并发送至下位机，再通过上位机转化为浓度显示。

2.2 激发波长与发射波长

使用三维荧光光谱仪测定了各类石油类物质（HJ油标准、重油、柴油、汽油、润滑油）的三维荧光图谱（见图2）。实验结果显示，HJ油标准、汽油、柴油、润滑油等的激发光波长主要在250～350 nm 范围内，发射波长为300～450 nm；重质油的激发波长为250～400 nm，发射波长为300～500 nm；HJ 油标准的主要成分是20号柴油，属于轻质油，因此其三维荧光图与其他轻质油接近。重油和轻质油三维荧光图谱的差异可能是由于石油分馏过程导致，重油和轻质油之间沸点的差异使重油含有更多的高沸点多环芳烃，而轻质油则含有更多的低沸点芳烃［17］。因此，确定石油类污染物的有效激发波长为250～400 nm，发射波长为300～500 nm。

图2 HJ油标准（A）、重油（B）、柴油（C）、汽油（D）、润滑油（E）及正己烷（F）的三维荧光图谱Fig.2 Three-dimensional fluorescence spectra of HJ oil standard（A），heavy oil（B），diesel（C），gasoline（D），lubricating oil（E） and n-hexane（F）

2.3 激发光源

常用荧光激发光源包括脉冲氙灯光源、汞灯、激光器、LED 光源等，氙灯和汞灯可提供多个波段的高强度紫外激发光，目前已有商品化的微型脉冲氙灯和汞灯，但由于本装置为水下浸入式探头设计，内部空间紧凑，微型氙灯和汞灯的体积对于本装置仍然较大而不适用。激光器光源亮度高、发光方向集中，但尚未发现具有合适波长的激光器。LED 光源具有较窄的谱线宽度，波长可选择性较多，可提供相对纯净的激发波长，且结构紧凑，体积小巧，便于集成和安装［18］，适合用于本装置。

根据石油类污染物的荧光激发与发射波长的测定结果，选择中心波长为254、275、305、365 nm的LED 光源，采用中心波长为360、450 nm 的带通滤光片滤除激发光和环境光干扰，使用光电二极管测定荧光（与光源夹角90°，使用比色皿测定），考察不同激发光源与检测波长的组合对石油类污染物的信噪比，结果如表1 所示。采用激发波长275 nm 与检测波长360 nm 组合时装置信噪比较好；采用365 nm 激发时，对HJ油标准的信噪比与254、305 nm 光源基本相当，对重油的信噪比高于二者。虽然365 nm 在各类油品中非最佳激发波长（见图2），但该波长的LED 发光效率远高于254～305 nm，由于检测荧光强度与激发光强度成正比［19］，因此使用高光辐射功率的365 nm 激发光源获得了与其他波长相当的信噪比；同时，由于能量转换效率的差异导致254～305 nm 的LED 光源发热和光衰较为严重，不适于长时间、高频次的原位监测。综合以上因素，最终选择365 nm的LED作为激发光源。

表1 不同波长LED光源对石油类污染物检测灵敏度的影响Table 1 Influence of different wavelength LED light sources on the sensitivity of petroleum pollutant detection

2.4 光路设计

图3 为本研究研制的荧光光路原理图，该光路利用二向色镜对特定波长的选择性透过和反射作用分离激发光与发射光，所采用的二向色镜为具有透过特定波长（≤400 nm）的激发光，可反射待测样品发射出的特定波长的荧光（≥400 nm）的光学特性。在激发光源开启状态时，激发光依次通过准直透镜（平凸透镜）、光源滤光片、二向色镜后，再通过聚焦透镜和光窗进入待测水样中。待测水样中的石油类污染物受到激发后，产生的荧光依次通过光窗和透镜，通过二向色镜反射作用，经过聚焦透镜、发射滤光片后进入光电二极管中进行测定。该设计的优点是，激发与发射光均从同一个光窗进出，入射和出射角度相对一致，可以更容易进行对位调整，减少了对光路对齐的要求，简化了系统结构，具有较好的光学系统稳定性和可靠性；同时，光窗垂直向下的设计可避免水体环境光的干扰。实验发现当激发光的光斑约为2～3 mm时可获得最大灵敏度。

图3 原位测油装置的荧光光路原理图Fig.3 Schematic diagram of the fluorescence optical path of in-situ oil measurement device

2.5 数据采集模块

在环境浓度下，石油类污染物产生的荧光强度非常微弱，如何精确放大光电二极管产生的微弱电流信号是保证装置具有良好灵敏度和抗干扰能力的关键［19］。该器件通过I/V转换电路、放大电路组成将微弱电流信号转换为0～5 V 的电压信号并输出，采用低纹波线性电源对该器件供电，消除高频噪声干扰，确保输出信号的准确性和稳定性。再通过AD 转换器将电压信号转换为数字信号并发送至下位机中，完成数据的采集。

2.6 结构设计与集成

研制的石油类污染物的便携式原位测定仪采用水下浸入式探头设计，整体构造如图4 所示，荧光光路模块安装于探头底部，激发光与荧光均从安装于底盖处的光窗进出；底盖、筒体外壳、顶盖均使用316不锈钢材料制成以应对海水、废水等环境中的盐离子、酸性物质和其他腐蚀性介质；I/V 转换放大器与光电二极管采用短线材连接，以避免荧光产生的微弱电流信号受干扰；使用三层固定安装支架分别安装LED 驱动电源、下位机以及正负线性电源以保证器件散热；外壳连接处均使用密封垫圈以及环氧树脂密封连接以防止液体渗漏。

图4 原位测油装置结构Fig.4 Structure of in-situ oil measurement device

2.7 性能验证

2.7.1 线性范围按照“1.2”方法使用船舶油配制重油、柴油、润滑油的水中油标准溶液，使用高纯水逐级稀释至一定倍数后，配制质量浓度分别为0、1、5、10、20 mg/L 的水中油溶液后，使用研制的原位测油装置浸入水体中至完全没入后，进行原位测定，实验结果见表2。3 种石油类物质在0～20 mg/L质量浓度范围时，线性结果良好。

2.7.2 干扰因素的考察为了考察原位测油装置的测定干扰，使用原位测油装置测定10 mg/L 水中油（重油）溶液，以及分别添加了腐殖酸和福尔马肼溶液的水中油混合溶液。结果如图5 所示，当溶液有机质（DOM）的质量浓度≤50 mg/L，浊度值≤10 NTU时，测定10 mg/L 水中油溶液的相对误差在10%以内。由于环境水体中DOM的质量浓度一般≤20 mg/L［20-21］，浊度值主要集中在10 NTU范围内［22］，因此实际环境水体在通常浓度下对本装置的测定结果影响较小，基本满足现场快速原位检测的需求。

图5 DOM质量浓度（A）及浊度（B）对测定10 mg/L水中油的影响Fig.5 Effects of DOM mass concentration（A） and turbidity（B） on detection of 10 mg/L oil in water solution

2.7.3 示值误差与重复性使用原位测油装置分别重复测定1 mg/L和10 mg/L的水中油标准溶液7次，根据公式：Δc=(-c-cs）/cs×100%计算装置的示值误差，式中Δc为示值误差；-c为7次测量值的平均值（mg/L）；cs为标准溶液的质量浓度（mg/L）。以测定值的RSD评价装置的重复性。测定结果如图6所示，高浓度和低浓度的水中油溶液的示值误差均在3%以内，表明准确性良好；在重复性方面，低浓度标准溶液的测定值的RSD虽然较高，但测定值基本在0.90～1.12 mg/L范围内波动，满足现场快速检测的需求。

图6 原位测油装置在低浓度（A）与高浓度（B）水中油标准溶液的示值误差与重复性Fig.6 Indication errors and repeatabilities of in-situ oil measurement device at low concentration（A）and high concentration（B） of oil in water

2.7.4 仪器比对测试配制一定浓度的水中油溶液a、b、c、d、e，分别使用原位测油装置以及实验室方法（使用正己烷萃取后通过三维荧光光谱仪测定）测定，对比两种测试方法的结果（图7A）。实验结果显示，使用实验室仪器测定结果与原位测油装置的测试结果非常接近，二者的差值基本在0.5 mg/L范围内。通过线性回归模型评价三维荧光仪与原位测油装置测量值的相关性（图7B），结果显示二者的测量值具有很强的相关性，相关系数（R）为0.999 8，表明原位测油装置与实验室检测方法之间具有良好的一致性。

图7 原位测油装置与实验室测试方法的结果比对（A）及其相关性分析（B）Fig.7 Comparison of results measured by in-situ oil measurement device and laboratory measurement（A） and its correlation analysis（B）

2.7.5 检出限以高纯水作为空白样品，使用原位测油装置连续测定11 次，以11 次测定值的3 倍标准偏差与标准曲线斜率之比计算原位测油装置对水中油的检出限为0.42 mg/L，该结果满足地表水环境质量标准（GB 3838-2002）IV和V类水质限值（0.5 mg/L和1 mg/L）的要求。

2.7.6 实际样品测定分别取500 mL地下水、河流水、工厂废水，使用实验室检测方法（见“1.3”）与原位测油装置测定水中油的浓度。实验结果见表3，原位测油装置的测试结果显示3种样品的加标回收率为91.2%～114%，说明研制的原位测油装置具有良好的准确性，可满足环境水体的原位检测需求。

表3 实际样品的测定及加标回收率结果（n=3）Table 3 Determination of real sample and its recoveries（n=3）

3 结 论

本文研制了一种基于荧光光度法的水中石油类污染物便携原位测定装置，与现有测试方法与仪器对比，本装置采用浸入式探头原位测定水中油浓度，避免使用萃取剂，具有准确度高、灵敏度好、使用成本低、仪器便携、环境友好等优势，可应用于各类水体中石油类污染物的原位快速测定。