牛乳质量检测方法的研究进展及其对乳品安全的意义

王歆远，刘 燕，布日额

（内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古通辽 028000）

牛乳质量检测与人类健康及疾病防控有着密切的关系，为了让民众喝上“安全奶”“放心奶”，乳品企业及卫生部门要对乳品的新鲜度、营养成分、致病菌污染情况进行全面检测。感官检测适合对乳品的新鲜度和被接受度进行初步判断，后续可以通过对其理化指标的检测来分析乳品营养成分的含量是否存在异常，以及通过微生物检测手段来判断乳源是否被致病菌感染[1]。

1 感官指标检测

感官评定是牛乳质量评估最简单的方式，是将乳品通过评价者的视觉、嗅觉和味觉来对乳品的色、香、味、质地等指标作出评判并进行分析和解释[2]。主要通过看、闻、尝3 个步骤进行感官指标检测[3]，可以直观地反映出牛乳的新鲜程度和是否变质。

（1） 看。品质正常的牛乳颜色呈乳白色或微黄色，牛乳中不应出现沉淀物或絮状物，不应有凝块产生[4]，通过观察乳品的颜色、流体状态可以判断出乳品是否变质。

（2） 闻。由于牛乳中脂肪酸的挥发，牛乳闻起来会有一种浓郁的奶香气。如果牛乳中有令人不悦的异味产生，说明其中的脂肪酸发生氧化，产生过氧化物，则认为牛乳发生了酸败现象。

（3） 尝。牛乳中乳糖的存在会让人喝起来有淡淡的甜味，牛乳中脂类物质可以使牛乳有顺滑、浓郁的感觉。如果品尝出酸或苦等异味，则说明牛乳已经变质。

2 牛乳理化指标检测

理化检验技术是牛乳质量检测最常使用的技术手段。理化指标检测通过分析乳品的物理特性或化学成分，能够得到其中各项营养成分的含量及实时变化情况，具有准确性高、说服力强的优点[5]。理化指标检测可以实现对牛乳新鲜度的检测，以及其中某一项营养成分，如蛋白质、脂肪含量的检测和牛乳中多种营养指标共同检测。

2.1 酸度测定

通过酸度的测定可评判出牛乳的新鲜程度。当牛乳在贮存和运输的环节中受到微生物污染时，其中含有的营养物质会被分解，牛乳中的乳糖会分解成乳酸，引起酸度的增高，称为牛乳的酸败现象[6]。酸度测定的方法是利用酚酞溶液作为指示剂，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.100 0 mol/L） 来滴定，计算滴定结束时所用氢氧化钠溶液的体积。

2.2 相对密度、比重测定

通过对牛乳的相对密度和比重的测定，可以反映出牛乳是否存在卫生问题。牛乳的相对密度和比重是通过密度乳稠计和比重乳稠计来测定的，当温度为20 ℃时，单位体积牛乳的质量与温度在4 ℃时单位体积水的质量之比则称为牛乳的相对密度，为1.028～1.032。当温度在15 ℃时，单位体积牛乳质量与单位体积水的质量之比称为牛乳的比重，为1.030～1.034[1]。如果牛乳的相对密度或比重值不在正常范围内，则可以推测为牛乳中的营养物质已经发生改变，诱发牛乳变质或者存在不良商家对牛乳掺水作假的嫌疑。

2.3 蛋白质检测方法

蛋白质是牛乳中重要的营养物质，通常情况下牛乳的蛋白质含量越多，代表着牛乳品质越好[7]，在牛乳的生产贮存过程中，蛋白质含量的变化情况也可以反映出牛乳质量的变化，当蛋白质含量降低时则可能牛乳发生变质[8]。现阶段，主要通过凯氏定氮法、考马斯亮蓝法和紫外分光光度法来检测牛乳中的蛋白质含量[9]。凯氏定氮法是目前应用最广泛的一种检测方法，该方法发展完善，有着成熟的检测体系和极高的准确度，不足之处是凯氏定氮法的试验周期相对较长，对试验环境要求较高。将经典的凯氏定氮法改良后，通过模块式消化来进行试验，是将牛乳进行微波消解技术处理后再测定蛋白质含量，这种改良方案提高了试验分析效率，减少了试剂用量，且对环境较为友好[10]。紫外分光光度法也在生产实践中广泛应用于牛乳蛋白质含量的测定，其利用牛乳中的蛋白质与紫外光的吸收程度存在着线性关系，通过测定样品的吸光度可以测定出蛋白质在乳品中的含量[11]。

2.4 乳脂检测方法

如果新鲜牛乳发生变质，则乳品总脂肪的含量会呈下降趋势[12]。在乳脂检测方法中，罗兹- 哥特里法被广泛应用，该方法有着技术成熟、发展完善、准确度高的优点，缺点是试验操作时间长且复杂，易产生污染[13]。相对于传统方法，伊尼霍夫碱法来检测牛乳中的脂肪含量可以实现试验周期大幅缩短、操作更为简便等优点，也被逐渐推广[14]。除以上2 种方法外，对牛乳中脂肪含量的检测还会使用核磁共振定量氢谱技术、巴勃科克氏法、盖勃氏法等[15]。

2.5 乳糖检测方法

乳糖含量在牛乳储存周期中的变化规律与牛乳变质不存在特定性的关系[8]。但在乳品质量检测时也应作为必不可少的一项营养指标。乳糖可以长时间滞留在人的肠道内，需要自身产生的乳糖酶分解，乳糖酶缺乏的人群会产生乳糖不耐受症，消费者可以从此项指标对牛乳进行甄别。对于牛乳中乳糖含量的测定，目前普遍采用蒽酮比色法和莱茵- 埃农氏法[16]。

2.6 低场核磁共振技术

低场核磁共振（NMR） 是一种对乳品质量检测的新兴技术手段，适用于对牛乳的多项营养物质含量进行检测，原理是通过牛乳在恒定磁场强度小于0.5 T 时所产生的核磁共振现象对其营养成分进行分析。低场核磁共振技术一般用来检测乳制品中蛋白质和脂肪的含量、水分子的迁移率及乳制品的保水能力等理化指标。在测定牛乳中蛋白质含量时，该方法有着极高的准确度，现阶段广泛应用于乳蛋白的快速检测[17]。利用双高斯公式拟合低场核磁共振测定得到的乳脂肪液相信号，也可以得出乳品中脂类物质的含量评判牛乳的品质[18]。

2.7 近红外光谱分析法

近红外光谱分析法（NIR） 是近年来新兴的绿色检测技术，可以实现对乳品中的脂肪、蛋白质和乳糖三大营养成分的共同检测分析。在现阶段牛乳质量检测技术中具有十足的发展潜力[19]。其原理是通过乳品中不同营养物质的含氢基团对不同频率的红外光进行选择性吸收来进行不同营养物质的动态监测。运用近红外光谱系统在线监控乳品中脂类含量的变化的技术已经被广泛使用[20]。也可以将近红外光谱分析技术结合偏最小二乘方法分析后形成的光谱数据信息，能够构建出牛乳中脂肪、蛋白质和乳糖含量之间的校正模型[21]，该模型可以分析出3 类营养物质含量的变化趋势。另外，近红外分析技术还可以对牛乳中的体细胞数进行检测[22]，当牛乳的体细胞过高时可能会引起风味欠佳、品质下降，乳品被污染等。

3 牛乳微生物指标检测

由于奶源致病菌防控关系到公共卫生安全，近年来各项技术速发展，检测技术可分为常规细菌鉴定技术、免疫学检测技术、基因检测技术和全基因组测序技术[23]。对一些致病菌的检出结果和检出率，各国卫生部门都已做出了明确规定。大部分国家的法规中，乳制品不得检测出弯曲杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌及产气夹膜梭菌，对于乳品中存在少量的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌，卫生部门对其检出率也有着明确的限量标准[24-25]。

3.1 常规细菌鉴定技术

常规细菌鉴定技术是检测细菌最基本的技术，其包括细菌分离培养、菌落特征观察、显微镜下观察及生化试验等。该方法优点是结果客观、准确，其不足是耗时、费力，至少48 h 才能获得结果，不适合对乳品的快速检测[23]。

3.2 免疫学检测技术

免疫检测的基本原理就是抗原抗体结合反应，当抗原和抗体在体外特异性结合后会产生免疫现象。在牛乳制品的免疫学检测中，可以利用牛乳中含有的已知抗原来检测未知的抗体，也可使用制备好的抗体来检测未知的抗原。对使用的抗原或抗体进行检测都可以确认乳品是否被致病菌感染[26-27]。免疫学检测技术在乳品中的应用主要有酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫磁性分离技术、酶联荧光免疫吸附技术（VIDAS） 等[28]。

3.2.1 血清学反应

血清学反应是最常规的免疫学技术，反应中所用抗体是血清，主要包括凝集试验和沉淀试验等。血清学反应可以检测出引起牛乳腺炎疾病的主要几种致病菌菌株[29]。凝集试验使用的抗原为颗粒性抗原，与抗体结合后会出现颗粒性凝集现象，主要用于布鲁氏杆菌和沙门氏菌等的检验。沉淀试验使用的抗原是可溶性抗原，抗原与抗体结合后会产生沉淀现象，在牛乳源致病菌检测中应用较少。

血清学反应的优势是其操作简便，可以直观观察到试验结果；其不足之处是试验人为影响因素较多而导致灵敏度较低，因此不适合进行大批量检测和现场快检。

3.2.2 抗体标记技术

抗体标记技术是将标记物与抗体分子共价结合后和所检测的致病菌特异性结合，形成抗原抗体结合物，再利用荧光显微镜、酶标仪及发光免疫检测仪对其进行定性和定量。

（1） 酶联免疫吸附试验。目前，应用最为广泛的方法是间接ELISA。ELISA 法通过底物呈现的颜色反应来达到检测目的，对于同种动物多种不同病原的检测只需要标记一种二抗，该方法适合批量检测。对牛乳中的沙门氏菌和黄曲霉素M1的定量检测有着极高的灵敏度[30]。全自动酶标检测仪和全自动洗板机在应用中的广泛普及，ELISA 操作的标准化程度明显提升[31]，该方法主要应用于我国内蒙古地区对奶牛乳腺炎的致病菌检测。

（2） 胶体金免疫层析快速检测技术。胶体金免疫层析快速检测技术是一种新兴的标记抗体快速检测技术，因为该技术所利用的抗体为单克隆抗体，其具有高特异性，试验结果的准确性和检测的灵敏度也得到保障，该方法的最大优势是操作简便，可以在10 min 内获得试验结果，结果易观察判别等，因而得到广泛应用。在检测时，不依赖试验环境和试验设备，使用组装好的成品试剂盒就可以随时在牧场中现场应用，对操作人员的专业性要求较低，适合于基层检测站和养牛户使用。我国相关研究机构已研发出“快速检测牛乳源无乳链球菌的胶体金免疫层析试剂盒”“快速检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析”“快速检测牛乳中牛结核分枝杆菌感染早期标识物的胶体金免疫层析试剂盒”等保障牛乳源安全的快检产品[32-33]。

3.3 基因检测技术

3.3.1 聚合酶链式反应（PCR） 技术

乳样中含有多种类的微生物，通过对细菌的特异性研究进行相应的PCR 试验，可检测出不同菌株，PCR 技术的广泛应用改变了在传统的培养技术中面对细菌多样性一直存在着试验准确度不高的问题。因为PCR 技术对单一细菌检测的高特异性，该技术在实际应用中得到普遍认可[34]，我国《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》中，明确要求对于乳制品中的阪崎肠杆菌的含量测定要采用PCR 技术手段来进行，目前普遍应用于婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测[35]。对于其他不同致病菌，在检测方法和检出率上也各不相同。对于牛乳中志贺氏菌的检测，最优方案是采用快速常规PCR 与实时定量PCR 相结合的方法[36]。乳品中的蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌也可以通过采用过滤富集菌体后PCR 技术来检测出[37-38]。

通过PCR 技术，也可反映出乳品中细菌群落结构及体细胞总数的动态变化。对于牛乳中的金黄色葡萄球菌可以通过免疫磁球捕获- 实时荧光PCR 法来检测，利用该技术可以快速检测出其含量，该方法的检测下限为104CFU/mL[39]。后通过对16S rRNA的V3 区进行扩增，并结合实时PCR，能够实现对牛乳中的总细菌数和特定细菌的种类进行动态监控[40]。总体来说，PCR 检测方法最大的优势就是特异性强、准确度高且试验操作较为简便，有很高的实用价值和推广价值[41]。

3.3.2 全基因组测序技术

通过对细菌全基因组DNA 测序、拼接、组装，可获取全部的基因组信息[42]，从而实现了功能基因注释及个性化分析。对分离菌株的基因功能研究、致病机制及免疫机制研究该技术的发展有着重要意义，对各地区不同情况的乳源安全问题可开展针对性研究，通过细菌生态学获取的信息，可深入掌握所在地区致病菌种的独立强弱及优势基因，提出相应的应对防控措施。

4 发展牛乳质量检测技术对乳品安全和公共卫生的意义

在我国的内蒙古地区，乳品质量检测技术的不断发展对当地奶牛业健康发展、保障乳品安全起到了巨大作用。有关科研机构调查结果表明，内蒙古地区牛乳安全问题主要由奶牛患有乳房炎流行病引起，其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌和大肠埃希菌是使奶牛感染乳房炎的主要致病菌[43]。对于以上致病菌的检测，利用生物学技术使致病菌抗原基因特异性表达，结合间接ELISA 方法可准确地在病源乳中筛查出无乳链球菌及金黄色葡萄球菌[44]。在基层牛乳检测应用中，现阶段研发出的快速检测牛乳源致病菌的胶体金免疫层析试剂盒有着极高的准确度[45]。内蒙古地区的乳源检测技术不断发展，使我国乳品质量安全得到保障。

德国有着严格的乳品检测制度，每个州都会设立一个独立的第三方检测机构来负责该州的乳品质量检测工作，检测站会定期对牧场收到的奶源进行批量检验，进行定级，对该牧场乳源的安全等级进行评定[46]。其工作内容主要是对牛乳的各项理化指标进行检测，对牛奶的脂肪、蛋白质含量和菌群数量等都进行详细的分析和监控。检测站得出的最终数据被法律认可，具有权威性，乳品加工厂会凭借该数据选择性地向奶农收购奶源。这样在源头上很大程度避免了乳品质量的安全隐患。

新西兰的乳品产业在国民经济中占有重要的地位，现阶段该国主流的检测手段是利用光谱仪对牛奶进行检测分析，牛乳样本被光谱仪射出的光扫过后，牛奶的不同成分会吸收不同波长的光，就可直观地得到牛乳样本的光谱信息[47]，然后由检测人员分析牛奶的成分是否存在着营养素的缺失、致病微生物的产生及质量变化的发生等。该检测方式一般都是在新西兰全境的牧场中进行抽样检测，既可在同一标准下评估乳品质量水平，又可有效减少检测时间和成本。

由于检测方法众多，在实际生产中应充分结合实际情况，选择最适宜的检测方法。传统检测方法不断改良研究并且与新兴技术结合，充分利用多元信息，将多种检测手段联合应用，开发出快速准确绿色的检测技术来有效保障牛乳制品的安全将是未来研究的一个趋势。牛乳品质检测技术的研究发展既促进了我国乳品行业的蓬勃发展，又为公共卫生安全提供了绝对保障。