禽源食品中沙门菌现场检测方法的研究进展

张 帅,江海洋

(中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室,北京 海淀 100193)

沙门菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,是重要的人兽共患病原菌之一[1]。因饮食习惯等因素,西方人感染的食源性致病菌中以沙门菌最为常见,其中50%～75%的媒介是加工不完全的肉、蛋等动物源性食品产品[2]。沙门菌血清型众多,Chen等[3]的报道显示,与人类、动物、鸟类、啮齿动物和爬行动物相关的沙门菌的血清型已经超过2 500种。明确常见的禽沙门菌血清型对于检测来说至关重要。禽源食品中报道较为频繁的沙门菌血清型有鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌,近期报道的还有海德堡沙门菌、肯塔基沙门菌、婴儿沙门菌和印第安纳沙门菌[4]。

据测算,我国每年因食用鸡肉导致的沙门菌食物中毒的发病人数达300多万人次,其中近半数与生鸡肉的交叉污染有关;我国居民厨房案板生熟分开的比例低(不足三成),未生熟分开的居民仅有半数用消毒剂清洗案板;用消毒剂清洗案板,发病人数可降低120万人次[5]。同样,使用清洗剂和消毒剂可以降低蛋壳表面细菌污染水平,但是消毒剂会造成另外的食品安全问题,或者使生产成本增加[6]。目前,我国国家标准规定,肉制品和即食用蛋制品中不允许检出沙门菌[7]。沙门菌检测方法的“金标准”是传统的生化培养法,检测步骤为预增菌、增菌、分离、生化试验和血清型鉴定5个步骤,此法是所有检测方法所得结果是否准确的参照,但从采样到出结果需要36 h甚至更长时间,不能满足食品安全快速检测的需求[8,9]。

要达到防止污染扩大化的目的,需要进行现场实时检测,及时确定被沙门菌污染的食品和批次并采取相关措施。本文就近年来新发展的适用于现场检测禽源食品中沙门菌的方法和技术进行综述,并探讨食源性致病菌动态监测体系的建设和发展。

1 禽源食品感染沙门菌现状

近年来,沙门菌引起的人类群体感染事件依旧频发。在美国,仅2021年就发生多起沙门菌感染事件,其中因冷冻裹鸡粉中存在肠炎沙门菌,导致36人感染,11人住院;因使用被沙门菌污染的火鸡粉导致33人感染,4人住院[10]。2015年以来,我国每年因沙门菌导致的食物中毒发病人数约达300万人次,其中近半数与生鸡肉交叉污染有关[11]。

相对于其他食物种类,家禽导致的沙门菌感染病例约占19.0%,鸡蛋约占14.8%[12]。因为饲养成本低且可以供食新鲜的蛋和肉,散养家禽普遍存在,其带来的污染风险不能忽视。沙门菌可通过多种媒介污染家禽,包括啮齿动物、猫和昆虫以及受污染的垃圾[13,14],散养鸡因缺乏管理,会接触到这些媒介,处理不当就会感染人类。除了养殖源头,在家禽屠宰和运输过程中,沙门菌也会感染肉和蛋。

2 可用于现场检测禽源食品中沙门菌的方法

2.1 基于分子生物学的快速检测 以分子生物学技术为基础的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR),通过对不同血清型沙门菌的DNA保守序列设计引物进行扩增,产物通过琼脂糖凝胶电泳,可根据电泳条带进行结果判定。在PCR技术的基础上发展形成了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),其不仅具备PCR技术的高灵敏度和高特异性,而且反应条件温和,可以相对减少沙门菌增菌培养时间,更易实现现场检测。

Priya等[15]研究了一种基于LAMP的产物显色测定法,可以用于目视检测沙门菌扩增产物,在没有任何富集的情况下检测限为 0.9 CFU/g。Hu等[16]开发了一种针对肠炎沙门菌特异性基因的扩增检测方法,使用 Genie Ⅲ小型仪器约35 min即可获得扩增曲线和结果。Zhang等[17]研究了通用接头PCR触发的链置换扩增反应,建立了一种灵敏度高且可视化的鼠伤寒沙门菌检测方法,恒温扩增后直接显色,肉眼即可判定结果,无需电泳,节省时间。因分子生物学检测方法灵敏度高,若能结合有效的DNA提取方法,即可进行现场检测。Antonia等[18]建立了一种简化的 DNA 分离方法,适用于在现场快速提取细菌DNA,可与上述方法结合使用,实现沙门菌的现场检测。

2.2 基于免疫学的快速检测 在食源性微生物的检测中,通过抗原和抗体特异性结合的快速检测方法被广泛研究和应用,主要的检测方法是酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和侧流免疫层析(Lateral flow immunoassay,LFIA),因其操作简单、不使用复杂仪器的特点,更适用于快速检测。但是,传统免疫学检测方法对食源性致病菌的灵敏度低,为了保持良好的特异性和稳定性,需要不断提高和优化抗体的质量和试验溶液体系。近年来,也有很多在此基础上对沙门菌进行快速检测的研究,主要目的是提高检测的灵敏度。

Gao等[19]应用脲酶的诱导作用形成银壳沉积在金纳米粒子表面,以改进ELISA的比色速率,快速灵敏地检测沙门菌,检测限达到1.21×102CFU/mL。Wu等[20]制备了鼠伤寒沙门菌单克隆抗体1B4,以此为基础开发的胶体金免疫层析试纸条对鼠伤寒沙门菌检测的视觉灵敏度达4×105CFU/mL。Ren等[21]研发了一种可用于现场快速检测肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的测流层析方法,其中盐诱导聚集的金纳米粒子作为信号探针用于信号放大,以改善T线的敏感性和特异性,可在 14 min内完成检测,其视觉灵敏度为1×103CFU/mL。

2.3 基于生物传感器的快速检测 近年来,生物传感器被广泛应用于快速检测食源性致病菌。生物传感器是将生物信号和物理或化学换能器结合并转化为可以监测信号的一类装置,其灵敏度高,体积小。对于沙门菌的检测主要是以抗原抗体或核酸适配体的特异性识别为基础,将生物信号放大并转化为光、电信号,通过建立信号强度与沙门菌浓度之间的关系判断检测结果,达到检测的目的[22]。

Jiang等[23]开发了一种带有自驱动聚对苯二甲酸乙二醇酯芯片的便携式印迹电化学传感器,用于快速检测沙门菌,带有虹吸管入口的芯片与反应室连接,经过创新设计实现自驱动进样和检测,检测限为100 CFU/mL,可在 20 min内检测出沙门菌,可应用于现场监测食品加工过程和食品流通过程中的沙门菌污染。Qi等[24]开发了一种微流体生物传感器,将混合、分离、标记和检测集成到单个微流控芯片上,使用具有酶活性的金属有机框架和树莓派(Raspberry Pi,RPi)来放大并分析生物信号,检测鸡肉中的鼠伤寒沙门菌,检测限为 14 CFU/mL,这种生物传感器有自动化程度高、反应速度快、所用试剂少和体积小等优点,有望用于食源性细菌的现场检测。Yin等[25]的研究将沙门菌特异性invA基因在规律成簇的间隔短回文重复-核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas12a,CRISPR-Cas12a)系统作用下形成脱氧核酶,可以在氯化血红素存在下催化四甲基联苯胺氧(Trimethylbenzene,TMB)反应,产物在 454 nm 处的吸光度增加而发生颜色变化,该生物传感器结合智能手机比色测定,可对沙门菌进行超灵敏检测,检测限为1 CFU/mL,是用于病原菌即时检测的新设计。

3 总结与展望

对于禽源食品中沙门菌的检测,在注重快速的同时,还要强调现场检测技术。无论是养殖场还是商场超市,只要能现场取样进行快速检测并出具结果,就可以在感染早期控制扩散,降低损失。而且,现场检测可以最大限度保持样本的原始性,可以从食品源头控制沙门菌污染,减小运输过程中带来的不可控感染,使检测结果更准确。

极少量的食源性致病菌经过繁殖后才会引起相关疾病,为快速准确地检测活菌,检测前的增菌是必要的,其也是整个检测过程中最耗时的一步。现场检测时,沙门菌存在于复杂的基质中,增菌后将其从蛋白质、脂肪和非目标菌中准确的甄别和捕获颇有难度。高效率的富集和捕获样品前处理方法可以缩短增菌时间。若没有样本前处理方法可以有效解决增菌或者富集问题,下游的检测技术将无法更好地发挥作用。Wang 等[26]研究发现,碳点-适配体复合物可作为一种新型荧光探针,用于定量检测鸡蛋样品和自来水样品中的鼠伤寒沙门菌,检测限为50 CFU/mL,无需任何样品富集过程,适用于现场检测。Du[27]等开发了一种基于原位富集培养的有效预处理方法,大大减少了增菌时间,结合液滴数字聚合酶链反应技术实现快速检测痕量沙门菌,可检测出低至 10-1CFU/mL 水平的沙门菌,用8 h完成包括前处理在内的整个检测过程。

Aliakbar Ahovan等[28]总结了微生物检测的理想化状态,即需要较短的分析时间(最好小于1 h),最少的操作技能,较高的稳定性,可检测单个细菌,可区分活细胞和死细胞,没有非特异性,不需要任何富集过程,若应用于实际环境检测,还需控制检测成本。目前,我国对于禽肉原料中沙门菌的限量没有明确规定,但是,禽肉在禽养殖场、运输、加工、储存和售卖等环节都有被沙门菌污染的风险,而且这些过程相当复杂,需要在每个关键点进行现场检测和监控,以防控代替治疗,大大降低养殖成本并减小损失。目前来看,需要整合各方面的研究成果,获得更高效的样品前处理方法,结合具有良好性能的生物传感器,形成灵敏且智能的检测终端,结合大数据的分析系统和预警系统形成智能化检测体系,从养殖源头到餐桌全链条的每个关键点进行实时监测,对沙门菌在禽源食品中的污染进行有效的防控。