施氮对铜镉污染土壤中大豆植株生长及氮磷钾含量的影响

崔永亮，罗 伟，吴航玉，吴 霜，余秀梅，程祖强，张玉婷，胡 骥

（1.四川省自然资源科学研究院，四川 成都 610041；2.四川省生态环境科学研究院，四川 成都 610041；3.四川农业大学 资源学院，四川 成都 611130；4.四川省自然资源科学研究院成都分院，四川 成都 610041）

0 引言

近年来工矿业的发展导致大量重金属和有机物等有毒化合物进入生物圈，对生物圈中的生物造成了极大危害。重金属污染物相比有机污染物更难以被降解，因此极易对生态环境和粮食安全造成巨大危害。据报道，矿业产生的重金属污染物有主要有铜（Cu）、镉（Cd）、镍（Ni）、铬（Cr）、铅（Pb）［1］，此类重金属污染物的环境危害潜力与富集时间正相关，通过在农用土壤富集进入农作物从而对人体健康产生危害。土壤重金属污染是破坏土壤健康和导致其生产力下降的重要原因之一，土壤中过量的重金属会对生态环境、动植物以及人类健康构成威胁［2］。随着工、农业的迅速发展，污染物在环境中的不断累积，导致土壤环境污染日益严重，尤其是土壤重金属污染因其高富集、难降解、毒性强等特点而越来越被人们所关注［3］。

我国土壤铜污染问题形势十分严峻，土壤中的铜含量伴随着铜矿开采、含铜农药的使用急剧增加，远远超出了土壤自身的承载能力。据报道，在污染严重的地区如铜矿区，土壤的铜含量可高达5000 mg／kg［4］。水中铜含量达0.01mg／L时，对水体自净有明显的抑制作用；超过3.0mg／L 时，会产生异味；超过15mg／L 时，无法饮用［5］。若用含铜废水灌溉农田，铜在土壤和农作物中的累积会造成农作物，特别是水稻和大麦的生长不良并会污染粮食籽粒。土壤中的铜含量一旦超过一定浓度，土壤微生物数量和种群结构将会被强制改变，土壤酶活性也会降低。镉在自然界中常以化合物状态存在，当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。镉被人体吸收后，在体内形成镉硫蛋白，选择性地蓄积在肝、肾中。其中，肾脏可吸收进入体内近1／3 的镉，是镉中毒的“靶器官”，会造成骨质疏松、萎缩、变形等一系列症状［6］。

重金属污染土壤由于受到重金属毒害，导致其中各类营养元素含量极低，抗逆性较差的植物无法生存。豆科植物具有较强的抗逆性，广泛分布于荒漠区、盐碱地等恶劣的自然环境中。同时豆科植物的根系可以与根瘤菌共生，起到固氮培肥、增加土壤有机质和氮素含量的作用，从而增加土壤肥力。因此豆科植物在重金属污染区域具有极大的农业和生态价值。氮素作为植物生长需要的最重要的大量营养元素之一，是植物体中蛋白质、核酸、许多辅助因子以及植物次级代谢物的主要组成成份，对植物的生长、代谢和遗传等都具有不可替代的作用。氮素代谢、光合作用、矿质元素吸收及呼吸代谢等过程，均会影响作物的形态和产量［7，8］。祖艳群等研究表明，重金属与氮素之间存在交互作用，且会对植物的生理代谢和遗传特征产生影响，通过合理利用交互作用有助于减轻重金属污染对植物的危害［9］。郭光光的研究显示，在人工污染土壤中施氮肥可以有效提高蓖麻的生物量及其对铜的转移率［10］。王晨骄研究发现，同时施用氮肥、磷肥能显著促进重金属污染土壤中植物的生物量，同时提高植物对重金属的耐受性，促进植物对重金属的富集、转移［11］。

虽然豆科植物的固氮作用使其比其他植物更有可能在重金属污染土壤中生长，但也有研究显示，重金属污染会导致豆科植物的根毛萎缩、根坏死，减少根瘤数量［12］，也会使根瘤细胞中固氮酶活性降低，影响豆科植物的固氮能力［13，14］，还会阻碍叶绿素合成，影响豆科植物的光合作用［15］。已有研究多关注如何筛选出具有重金属抗逆性的根瘤菌与豆科植物建立联合修复体系［16，17］，也对刺槐、紫花苜蓿、紫藤等多种豆科植物进行了广泛研究［18，19］，但对施氮条件下大豆对重金属的响应研究相对较少，因此，本文拟通过研究施氮条件下铜、镉污染如何影响大豆生长来了解土壤重金属对豆科植物的危害，探讨利用施氮提高重金属污染土地利用效率的方法是否具有可行性。

1 实验材料和试剂

大豆种子：南豆12。南豆12 是南充市农业科学院选育的具有超高蛋白抗逆高产等多项优良性状的大豆新品种［20］，研究其在重金属污染土壤中的表现有利于推动探讨如何在治理重金属污染的同时兼顾经济效益，提高重金属污染土壤的利用效率。

无氮营养液：KCl 0.5g／L、CaSO40.2g／L、MgSO40.2g／L、KH2PO40.2g／L、C10H12FeN2NaO81mg／L、CaCO32g／L、H3BO32.8g／L、ZnSO40.2g／L、CuSO40.5mg／L、MnCl20.5mg／L、Na2MoO40.1mg／L。

含氮营养液：在无氮营养液中加入浓度为1g／L的KNO3。

重金属盐：CuCl2·2H2O 43mg／L 和CdCl2·2.5H2O 8.1mg／L。

2 研究方法

2.1 前处理

种子发芽。选择均匀饱满的南豆12 种子，放入装有浸湿滤纸的培养皿中，温室避光萌发。

盆栽实验。盆栽土壤分别为含有16mg／kg 的Cu2＋和4mg／kg的Cd2＋的土壤，将不含Cd 和Cu 的相同土壤作为对照，并将对照、镉污染土壤组、铜污染土壤组分别编号为MH（0）、Cd（4）、Cu（16）。为了分析施氮对大豆植株的影响，设置不施用氮作为施氮（1g／L HNO3）处理的对照，施氮和不施氮分别编号为N＋和N－，各处理均设置三盆重复。待大豆种子萌发后，在超净工作台将其种于盆栽中，每盆3颗种子，在表面铺上一层石英砂，放入人工气候培养箱培养；培养箱设定模拟昼夜交替，光照17h，温度为25℃，湿度80%；黑夜7h，温度17℃，湿度85%，以准确测定施氮对镉和铜污染土壤中大豆植株的影响。

2.2 生长指标测定

在培养40d后，每个处理随机取6 株大豆样品，自来水冲洗大豆植株，自来水洗净植株表面后用超纯水润洗。将植株表面擦干后测定大豆植株株高、根长、茎粗、生物量等生长指标。

2.3 植株生理生化指标测定

将收获的植株称重，记录鲜重后在105℃下杀青30min，80℃烘至恒重，称干重。磨碎过60 目筛。采用浓H2SO4—H2O2湿法消化植物样，并分别采用凯氏定氮法、钼锑抗比色法、火焰光度计法进行植物样品氮、磷、钾含量的测定。

浓H2SO4—H2O2湿法消化植物样。取5g 植物样与三角瓶中，加入约5mL浓硫酸浸泡一晚。将三角瓶放置在消化炉上加热。分批滴加30% H2O2，加热，内容物的颜色由黑色逐渐变成棕色、棕黄色，最后成为浅黄色或无色的澄清溶液。消化至此完成，需时大约30min。消化液中可能会有少量棕色的无定型疏松状固体浮于液面。冷却后定容为50mL，进行过滤，滤液供测试使用。

凯氏法测定植物样中的氮含量。将滤液中加入5mL硼酸指示溶剂，置于全自动凯氏定氮仪上进行加碱蒸馏3min，将试样中的氨通过冷凝由H3BO3溶液直接吸收，并用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收液，记录盐酸滴定体积，计算样品中全氮含量。

钼锑抗比色法测定植物样中的全磷含量。取10mL滤液于100mL容量瓶中，加入10mLH3BO3溶液，再加入两滴二硝基酚指示剂，摇匀，用H2SO4和NaOH溶液调节pH 至溶液刚呈微黄色，再加5mL钼锑抗试剂显色，并用蒸馏水定容。摇匀后，置于室温下显色30min，用分光光度计在700nm 波长下进行比色，读出测定液的吸收值。

火焰光度法测定植物样中的全钾含量。吸取滤液5mL于25mL容量瓶中，用水定容，直接在火焰光度计上测定，记录检流计的读数。

2.4 重金属含量的测定

用混酸（VHNO3∶ VHClO4＝4∶ 1）消煮植物样品重金属。所有样品的重金属的测定用ICP—OES方法上机测定，并用国家标准重金属溶液作为参比。

2.5 数据分析

本研究使用Microsoft office 2010 对数据进行统计，使用SPSS17.0 对数据进行显著性差异的分析，并使用Microsoft office 2010 对数据进行作图。

3 结果及分析

3.1 铜、镉污染下施氮对大豆生长的影响

由表1 可知，在所有处理中，施氮对根长没有显著的促长作用。在无重金属污染的土壤中，施氮显著提高了大豆植株的株高、茎粗和生物量，分别增加了32.32%、46.42%、247.58%。在铜、镉污染土壤中，施氮对大豆的株高、茎粗、生物量也起到了一定的促进作用，但对不同处理条件下的影响程度不同。在铜污染土壤中，施氮使大豆的株高、茎粗和生物量分别增加了43.38%、12.12%和162.01%；在镉污染土壤中，施氮使大豆的株高、茎粗和生物量分别增加了47.67%、20.68%和218.69%。在不施氮处理条件下，铜和镉并没有显著影响大豆的株高、茎粗和生物量，但使株高下降了2.36%和1.70%，生物量下降了17.74%和33.87%，茎粗上升了16.90%和3.57%。在施氮处理条件下，铜和镉虽未显著影响大豆株高与茎粗，但大豆株高分别上升了5.63%、9.60%，茎粗则分别下降了9.86%、12.99%，同时大豆生物量分别下降了24.61%、39.36%。

表1 镉、铜污染土壤中大豆的生长状况和生物量Table 1 Growth and biomass of soybean plants in the copper or cadmium contaminated soil

3.2 对大豆植株营养指标的影响

3.2.1 对大豆植株氮含量的影响

由图1 可知，在未施氮的处理条件下，土壤中的铜和镉未显著影响大豆茎和叶中的氮含量，但显著影响了大豆根的氮含量，使其分别下降了49.88%和52.74%。在施氮条件下，土壤中的铜和镉使大豆根部氮含量下降了42.88%和28.31%，叶部氮含量下降了2.78%、33.95%，但未对大豆茎部的氮含量有显著影响。在无重金属污染的土壤中，施氮显著促进了大豆植株根茎叶的氮含量，分别增加了43.92%、116.95%、57.60%。在铜、镉污染土壤中，施氮对大豆植株氮含量也起到了一定的促进作用，但对不同处理条件下的影响程度不同。在铜污染土壤中，施氮使大豆根、茎和叶中的氮含量分别增加了64.52%、135.71%和55.48%；在镉污染土壤中，施氮使大豆根、茎、叶的氮含量分别增加了120.20%、138.25%、10.21%。

图1 大豆根、茎、叶的氮含量Figure 1 Nitrogen content in root，stem and leaf of soybean plants

3.2.2 对大豆植株磷含量的影响

由图2 可知，在未施氮的处理条件下，土壤中的铜未影响大豆根、茎的磷含量，但使大豆叶部磷含量下降了50.18%；土壤中的镉使大豆根、茎、叶的磷含量分别下降了70.26%、75.87%、70.42%。在施氮条件下，土壤铜和镉未对大豆根、茎、叶的磷含量产生显著影响。在无重金属污染的土壤中，施氮对大豆植株根、茎、叶的磷含量有显著影响，分别下降了78.19%、93.03%、65.98%。在土壤铜、镉污染条件下，施氮对大豆植株的磷含量影响各不相同。在铜污染土壤中，施氮使大豆根、茎、叶的磷含量分别下降了79.72%、80.30%、43.71%；在镉污染土壤中，施氮使大豆根、叶的磷含量分别上升了66.93%、10.75%，茎部的磷含量下降了13.46%。

图2 大豆根、茎、叶的磷含量Figure 2 Phosphorus content in root，stem and leaf of soybean plants

3.2.3 对大豆植株钾含量的影响

由图3 可知，在未施氮的处理条件下，铜显著影响了大豆根的钾含量，使其下降了27.53%，但土壤镉未显著影响大豆植株的钾含量。在施氮条件下，铜和镉只对大豆根的钾含量产生影响，使大豆根的钾含量分别下降了22.99%和24.05%。在无重金属污染的土壤中，施氮使大豆植株根、茎、叶的钾含量分别增加了31.13%、36.00%、79.03%。在土壤铜、镉污染条件下，施氮对大豆植株的钾含量影响各有不同。在铜污染土壤中，施氮使大豆根、茎、叶的钾含量分别增加了39.31%、61.43%、104.69%；在镉污染土壤中，施氮也使大豆根、茎、叶的钾含量分别上升了10.97%、37.36%、47.49%。

图3 大豆根、茎、叶的钾含量Figure 3 Potassium content in root，stem and leaf of soybean plants

3.3 对大豆植株重金属含量的影响

由表2 可知，在土壤铜、镉污染条件下，施氮对大豆植株各部分重金属含量影响各不同。在镉污染土壤中，施氮均减少了大豆根和茎的镉含量，使其分别下降了50.98%和78.28%。在铜污染土壤中，施氮仅使大豆根中的铜含量显著下降了48.91%。尽管土壤中镉的含量低于铜，但大豆根吸收的镉含量却高于铜含量。在未施氮的处理条件下，大豆根、茎中的镉含量均高于铜含量，但大豆叶中的铜含量高于镉含量。在施氮条件下，大豆茎、叶中的铜含量高于镉含量，而在大豆根部镉含量高于铜含量。

表2 镉污染土壤中大豆镉含量与铜污染土壤中大豆铜含量（单位：mg／kg）Table 2 Cadmium content of soybean plants in cadmium contaminated soil and copper content of soybean plants in copper contaminated soil（Unit：mg／kg）

4 讨论

土壤受铜、镉等重金属毒性的影响而相对贫瘠，植株难以生长生存，而通过施加氮肥，能够良好的缓解土壤中重金属的毒害作用［21］，提高大豆生物量和营养元素的积累，使重金属污染土壤中植物增产［22，23］，提升了重金属污染土地的利用效率。因此，本研究主要通过铜、镉污染土壤中大豆的盆栽实验，揭示了铜、镉污染土壤中施氮不仅对大豆生物量及营养元素积累有不同程度的积极作用，还能有效降低大豆植株对污染土壤中铜、镉的富集程度，间接提高大豆植株在重金属污染土壤中的生产效率。

在施氮或不施氮条件下，土壤中的铜、镉污染均会对大豆植株的生长产生抑制作用，可能是因为重金属会降低植物叶片中的叶绿素含量，同时抑制了土壤微生物如根瘤菌的活性，从而影响植物对氮素的利用［24，25］。但施氮后，大豆株高、茎粗和生物量均有提升，可能是因为氮素的添加提高了叶片中叶绿素含量，光合作用加强，从而缓解了土壤重金属对大豆植株的毒害作用［26］。施氮对土壤铜污染给大豆带来的毒害缓解作用比对镉毒害的缓解作用更强，可能是由于不同重金属影响植物氮素利用的方式不同。镉污染会影响植物中的硝酸还原酶、谷氨酸还原酶等氮代谢关键酶的活性［27］，而铜污染则会影响植物中抗氧化酶的活性［28，29］。此外，本研究结果显示，铜、镉污染土壤中的大豆长势反而好于没有重金属污染土壤中的大豆，这是由于铜作为植物生长所需的微量元素参与了植物的呼吸作用、光合作用等过程，因此少量铜元素在一定程度上能促进大豆的生长［30，31］，而镉则可能通过增加植物中过氧化物酶的活性来促进植物生长［32］。

从大豆植株中营养元素含量来看，土壤铜、镉污染对大豆植株的营养元素积累存在不同程度的影响，而施氮可显著增加大豆根、茎、叶中氮、钾营养元素的含量。土壤铜、镉污染对大豆根的氮积累影响较显著，而施氮对于缓解茎部的铜、镉胁迫的效果最好，根部次之。施氮也可缓解大豆叶部受到的铜胁迫，且比缓解镉胁迫的效果更好，而根部、茎部则相反。施加氮肥对于铜污染土壤中大豆根茎叶的磷含量无影响，但提高了镉污染土壤中大豆根、叶部的磷含量。但施氮使部分处理中大豆的磷含量下降，这可能是由于氮元素营养量的增加抑制了大豆各部分对于磷的吸收［33］。土壤铜、镉污染对大豆根部的钾的吸收积累表现出抑制作用。铜、镉污染土壤中施氮使大豆根、茎、叶的钾含量均有所提高，其中叶部的钾含量提高最为显著，茎部次之。此外，在铜、镉污染土壤中，施氮显著降低了大豆植株中铜、镉的含量，使土壤铜、镉污染对大豆植株各部分的毒害作用减小。其中，施氮使大豆茎中的镉含量降低幅度最大，说明施氮能有效缓解镉对大豆茎部的胁迫；施氮使大豆根中的铜含量降低幅度最大，说明施氮能有效缓解铜对大豆根部的胁迫。

综上，在铜、镉污染土壤中施加氮肥能缓解铜、镉对植物的毒害作用，增强大豆在重金属污染土壤中的抗性［33］，减少重金属污染土壤中的污染元素在大豆植株中的富集，对大豆植株生长有促进作用，尤其是对于大豆根茎叶在铜、镉土壤污染下的氮元素和钾元素的吸收有显著的积极效果。施氮能够有效提升重金属污染土壤中大豆的产量与品质，在后续实际应用过程中，能同时兼顾土壤重金属污染修复和经济效益，有效提高重金属污染土地的利用效率［34］。

5 结论

在铜、镉污染土壤中施氮对大豆生长、生物量、营养元素积累有显著的促进作用，同时还能有效降低大豆植株中的铜、镉含量，有效缓解土壤铜、镉污染对大豆植株的危害，但不同重金属污染土壤中施氮对大豆植株的影响程度各不相同。因此，本研究明确了氮素在缓解土壤重金属污染对大豆植株危害中的积极作用，为利用施氮来提升重金属污染土壤中大豆的生产效率提供理论依据，也为进一步提升重金属污染土地的利用效率提供技术支撑。