液体活检标志物在非小细胞肺癌中的临床应用和挑战

周韵斓 沈立松

（上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092）

肺癌是全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]，2020年我国新增肺癌患者约82万例，新发和死亡人数均居我国恶性肿瘤之首，且仍然呈上升趋势[2]。临床上常用的传统肿瘤标志物在肺癌的筛查、诊断和个体化治疗、监测等方面有较多不足。影像学检查和穿刺或手术病理学检查也不能满足肿瘤动态监测的需求。伴随精准医学应运而生的液体活检技术，基于患者血液、痰液和胸腔积液等各种体液样本获得反映肺癌肿瘤组织特征的生物标志物，样本易于获取，且可反复、多次取样，真正实现了“实时活检”。近年来，随着检验和分析技术的发展，基于循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）、非编码RNA等标志物的液体活检不仅能揭示肺癌基因全貌，还可以监测肺癌基因的动态变化[1]。本文拟探讨液体活检在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的临床应用及其前景和挑战，以期为后续的临床研究提供参考。

1 肺癌的早期筛查和诊断

低剂量螺旋计算机断层扫描（low dose computed tomography，LDCT）用于肺癌早期筛查灵敏度高，但鉴别恶性结节时存在假阳性和过度诊断的问题。液体活检作为影像学检查的补充，其作用已得到广泛的认可。

CTC是从原发肿瘤灶脱落进入体液的肿瘤细胞。有研究发现，在慢性阻塞性肺疾病患者中检出CTC，可以早于LDCT发现高风险人群中的早期肺癌患者[3]。目前，CTC的临床应用已从最初的简单计数，发展为鉴定分析肿瘤特征性CTC分子表达谱。但鉴于CTC的稀有性，现有CTC富集和分选方法的灵敏度不足，尤其在早期肺癌患者中存在检出率低的问题。与传统的抗原抗体依赖的检测方法相比，叶酸受体靶向的CTC分选技术，利用肺癌细胞高表达叶酸受体的特点，结合聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，可提高早期肺癌CTC的检出率[4]。

ctDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到血液中的DNA[5]。检测其片段化可以辅助肺癌的筛查，早期拦截的片段化DNA评估（DNA evaluation of fragments for early interception，DELFI）与LDCT联合可显著提高肺癌筛查的效能[6-7]。ctDNA甲基化在肿瘤发展中起着关键作用，异常的基因启动子甲基化在癌前即可检出病变，揭示特定肿瘤原发灶来源，是癌症早期诊断的理想标志物。血浆SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化可作为早期肺癌辅助诊断的生物标志物，基于肺泡灌洗液样本联合检测这2个基因的甲基化水平，对肺癌的总体诊断效率优于血浆样本[8]。多癌种早期检测（multi-cancer early detection，MCED）研究发现，ctDNA甲基化诊断肺癌的特异性达到99%[9-10]。此外，对ctDNA的多个CpG位点甲基化水平进行靶向DNA甲基化测序，结合计算机深度学习，构建肺结节良性、恶性鉴别诊断模型，对于早期肺癌具有较好的诊断效果[11]。

EV是活细胞以旁分泌的形式释放到微环境中的膜性小囊泡，包含各类蛋白质、核酸、脂类和细胞代谢物。EV中的非编码RNA，包括miRNA和环状RNA均被证实有助于NSCLC的早期诊断，并且有助于鉴别腺癌和鳞癌[12]。从现有的研究结果来看，miRNA的组合比单个miRNA的诊断效能更高，血浆微小RNA特征分类器（microRNA signature classifier，MSC）和微小RNA测试（miR-Test）等都是多个miRNA组合的代表[13-14]。

对于早期NSCLC而言，液体活检的诊断效能仍然有限，其原因是在低全身肿瘤负荷、单病灶受累、无胸外转移扩散的情况下，检出的CTC、ctDNA或非编码RNA含量较低，过度依赖高灵敏度的检测方法。LDCT和液体活检分别从肺结节生长的形态和分子层面提供宏观和微观的信息，两者用于早期筛查相辅相成。液体活检可作为LDCT的联合或下游检测，如将其置于上游，仍需谨慎。

2 肺癌靶向治疗药物筛选和耐药监测

在致癌基因驱动的NSCLC中，准确的分子分型是精准治疗的前提。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是NSCLC的主要突变基因，突变率为46%[15]。与NSCLC相关的EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区域的18～21号外显子上，有大型临床试验结果表明，基于EGFR基因的靶向治疗在EGFR敏感突变阳性的晚期NSCLC患者中疗效优于化疗，可改善其生存和预后[15]。所有NSCLC患者均应检测EGFR基因，以筛选是否能受益于酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的治疗。目前，我国已常规开展EGFR基因突变的检测。虽然长期以来突变的检测以组织病理学活检作为金标准，但其受限于活检组织的可用性和可及性，且难以避免肿瘤异质性的问题[16]。

血浆ctDNA是对NSCLC患者进行基因分型的有效工具，与组织病理学分析结果互补，用于筛选靶向药敏感突变阳性的患者，指导获得性耐药患者更换靶向药物，评估靶向治疗的效果。临床研究支持将ctDNA分析扩展到指南推荐的其他可靶向的致癌驱动基因变异，包括ALK、ROS1、RET、MET外显子-14跳跃突变、BRAF、KRAS、HER2、NTRK、MET扩增[17]。对于初治患者，当没有可用于肿瘤基因检测的组织时，可采用“血浆优先”的方法，如果血浆ctDNA不能提供基因分型的信息，再重复组织活检；当组织量不足或不确定是否足够进行基因检测时，同时采用组织和ctDNA“互补检测”；当组织量足够基因检测时，可先行组织检测[18-19]。对于经治患者，液体活检具有样本周转时间短，无创，且可反复取样，克服肿瘤异质性的优点，可作为评估NSCLC患者靶向治疗疗效和耐药监测的首选方法[18-19]。有50%的获得性耐药患者可出现EGFRT790M突变，可通过动态检测其血浆EGFRT790M突变进行耐药监测，及时更换不同代的TKI[20]。

免疫检查点抑制剂（checkpoint immunotherapy，CPI）治疗显著改善了非致癌基因驱动的NSCLC患者预后。血液肿瘤突变负荷（blood tumor mutational burden，bTMB），即每百万碱基中检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，被证实是与CPI疗效相关的新兴生物标志物[21]。有较高bTMB的NSCLC患者采用CPI单剂治疗后，无进展生存期更长[22]。需要注意的是，目前bTMB临床研究选用的临界值取决于不同的商品化试剂，其检验结果在不同肿瘤种类和检测平台之间的差异较大；对于进行化疗的患者，bTMB疗效评估的依据尚不足。另一个标志物是CPI治疗开始后ctDNA水平的定量和动态变化，但适应症尚不明确，有待更多前瞻性临床试验结果加以确认。此外，CTC上的程序性死亡受体-配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）的表达可用于筛选适合进行CPI治疗的患者，并进行疗效监测，分选后的CTC也可以鉴定EGFR、KRAS、ALK、ROS1、c-MET等多种突变[23]，但这都需以高灵敏的CTC富集和分离方法作为前提。

3 监测肺癌复发转移和微小残留病灶

在实体肿瘤中，微小/可测量残留病灶（minimal/measurable residual disease，MRD）是经过治疗后，残留在患者体内的少量对治疗无反应的肿瘤细胞，提示恶性肿瘤的持续存在和临床复发进展的可能性[24]。传统影像学或实验室检查无法发现MRD，可通过连续取样和实时活检，采用液体活检（如ctDNA和CTC）方法检测到肿瘤来源的分子异常，进而检出MRD。因此，MRD也被称为分子残留病灶。

治疗后连续监测ctDNA可以在影像学进展之前就检测到肿瘤的复发[25]。TRACERx研究根据变异等位基因频率来检测血浆中的肿瘤亚克隆，在治疗过程中，监测ctDNA能够发现导致肿瘤转移复发的新亚克隆[26]。这些新的亚克隆来源于自然病程中肿瘤细胞的克隆进化，以及化疗药物对肿瘤细胞的克隆筛选。有研究结果显示，手术后和新辅助治疗后ctDNA检测阴性可较其他指标更好地预测患者预后[27]。

基于ctDNA的MRD检测主要分为两大技术路线，分别为肿瘤先验的分析和肿瘤未知的分析，目前均处在探索阶段[28]。前者先对原发肿瘤进行测序以鉴定患者的特异基因组变异，然后针对肿瘤特异性的克隆位点设计引物进行个体化ctDNA检测，判定MRD的阴性/阳性，敏感性和准确性高，但检测成本也较高，且耗时长；后者采用固定的基因包组合，通过一组预先选定的ctDNA引物，检测与肿瘤相关的已知基因组变异和表观遗传学改变特征，检测成本较低，周期短，但敏感性略低[29]。

CTC也可作为治疗后MRD检测的指标，是晚期NSCLC无进展生存期和总生存期的独立预后指标[30]。CTC中驱动基因的突变与ctDNA检测互补，可以提高MRD检测的敏感性和特异性。

MRD检测的临床应用价值是毋庸置疑的，但目前相关临床研究仍处于证据累积阶段，不同研究关于MRD检测试剂平台、测序深度和阳性判定的阈值定义差异较大，研究结果难以完全互通。目前，推荐检测方法必须可稳定检测出丰度≥0.02%的ctDNA[31]。检测结果需要排除克隆性造血的干扰。另外，在NSCLC根治性治疗后，何时开始监测MRD和监测频率尚未达成共识，临床也应关注。

4 液体活检的检测技术

ctDNA片段化明显，半衰期短，占cfDNA的比例不到1%，且在早期肿瘤和治疗起效后ctDNA比例大幅下降，因此对检测技术的灵敏度要求较高。ctDNA突变检测技术主要分为两大类[32-33]。第1类基于PCR技术，如超级扩增阻滞突变系统（super amplification refractory mutation system，super-ARMS）、基于小珠/乳浊液/扩增/磁性技术（bead，emulsion，amplification and magnetic，BEAMing）、数字PCR，都已广泛应用于ctDNA的检测，多重数字PCR可实现靶向基因突变多位点同时检测。第2类基于下一代测序技术（next generation sequencing，NGS），如全基因组测序、癌症个体化深度测序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPPSeq）。近年来，Lung-CLiP算法等机器学习领域的发展提高了NGS分析的灵敏度和精准度[34]。

基于PCR的技术适用于对已知特定位点进行检测，数字PCR可以实现cfDNA突变的绝对定量，分析灵敏度好，但NGS平台的检测范围更广泛，在未知突变及多靶点突变的检测性能上具有独到之处。NGS技术通过增加测序深度、采用UMI分子标签和纠错算法，可显著提高检测的灵敏度。鉴于晚期NSCLC需要评估的癌基因靶点众多，采用经临床验证的NGS平台检测血浆ctDNA，效能优于基于PCR的单基因分析方法。在临床实践中，还需综合考虑是否得到我国国家药品监督管理局批准的成熟的商品化试剂盒和检测成本问题，采用实验室自建方法，应进行性能验证，并严格按照标准化程序进行。

随着年龄的增长，NSCLC患者克隆性造血也会增加，外周血样本中检测到的基因变异可能是造血干细胞随机获得的突变，而并非肿瘤驱动基因来源的ctDNA变异[35]。区分ctDNA衍生突变和克隆性造血相关突变，可以对有核白细胞进行平行深度测序，但会显著增加检测成本。

CTC的分离和鉴定依赖于特殊的设备和方法，目前主要的方法包括微流控芯片分选、纳米磁珠分选、基于抗体的免疫荧光检测、荧光原位杂交技术、PCR、测序和细胞培养后的基因分析[31]。但这些方法尚无法从根本上改善CTC检出率低的问题，尤其在肿瘤早期，CTC的检出率极低。CTC计数的参考区间因分离鉴定方式的不同而不同，且不同方法之间差异较大。由于肿瘤存在异质性，检出的单个CTC不能代表肿瘤的全面状态。这些问题使CTC的临床应用仍具有一定的局限性。

分选得到的CTC通常仅有十余个，其下游肿瘤细胞分子特征的分析需要单细胞测序来完成，通过全基因组或全转录组扩增极少量的DNA或RNA，以满足测序所需的检测极限。目前，多数采用基于退火和循环的多个扩增循环技术（multiple annealing and looping-based amplification cycle，MALBAC）一般均是结合全基因组测序来进行，但尚不能达到常规临床应用所需的敏感性和特异性。

5 特殊类型样本的检测

除血液外的其他类型体液，如胸腔积液、痰液、唾液，还有肺泡灌洗液，均也可以作为肺癌液体活检的样本。中晚期NSCLC恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）中富含肿瘤细胞，且样本易于采集，上清液中总cfDNA含量显著高于血浆。有研究结果显示，肺癌伴MPE患者的胸腔积液样本中检测到的EGFR突变丰度高于外周血样本，而且不存在克隆造血的干扰，检测结果与组织样本的一致性达87.1%[36]。MPE中分离的EV来源的DNA和miRNA含量更高，可用于NSCLC的辅助诊断和鳞癌与腺癌的鉴别[37]。胸腔积液样本的检测结果可以用于NSCLC分子分型、肿瘤耐药突变分析、精准靶向治疗、预后评估。然而，在血液以外的其他类型体液样本中，患者个体间的差异更大，临床诊断临界值的设置和验证更具挑战性。

6 总结

液体活检技术具有便捷、无创、可重复等优势，在NSCLC的筛查和早期诊断、分子分型和靶向药物筛选、耐药监测、疾病进展与转移监测、预后评估等诸多方面都具有独特的优势和广泛的临床应用价值。未来机器学习模型将综合液体活检的多组学检测，有望进一步提高诊断效能。

目前，液体活检的临床应用推广都存在着相似的困境：检测技术仍需不断改进，以提高敏感性和特异性；检测方法学差异大，参考区间的临界值取决于各基因包组合和检测平台，较难统一标准；同时，检测成本也是需要考虑的问题。相于液体活检的大量基础研究，临床实际转化应用尚显不足。

基于液体活检报告的复杂性，需要专门的多学科分子肿瘤专家组提供具有临床价值的结果解读，协助临床作出治疗决策。