双相培养在肺结核诊断中的价值

刘 君 陈丽艳 涂 凡 芮小红 张莹莹

（1.江南大学附属无锡市第五人民医院检验科，江苏 无锡 214000；2.无锡市河埒街道社区卫生服务中心检验科，江苏 无锡 214000）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性感染性疾病，是单一传染病致死的首要原因[1]。我国的结核病负担居世界第3位，其中肺结核是最常见的结核病类型。结核病的准确和及时诊断对于患者管理和疾病控制至关重要。目前，结核病诊断主要通过培养法（金标准）、世界卫生组织推荐的Xpert MTB/RIF和T细胞斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等。然而，上述技术虽然有较高的敏感性，但存在耗时长、成本高等不足。因此，简便、快速且低成本的诊断技术是我国结核病防控的关键。本研究拟分析双相培养技术在结核病，尤其是肺结核诊断中的价值，为临床诊治提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年7—12月江南大学附属无锡市第五人民医院临床确诊肺结核患者175例，其中男121例、女54例，年龄（56.7±19.7）岁。肺结核诊断依据我国卫生行业标准WS 288—2017《中国肺结核诊断》。入组流程见图1。本研究经无锡市第五人民医院伦理委员会审核通过（2021-021-1）。

图1 研究对象入组流程图

1.2 仪器和试剂

ST-16型细胞离心机和HERAcell 150i CO2培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific有限公司；Xpert MTB/RIF试剂盒购自赛沛（上海）公司；2% N-乙酰半胱氨酸-NaOH溶液和0.5% NaOH溶液由实验室自配；T-SPOT试剂购自上海复星医学诊断公司；抗酸染色液、中性罗氏培养基购自珠海BASO公司；复苏促进因子（resuscitationpromoting factor，Rpf）培养液由上海市公共卫生临床中心结核病感染免疫课题组惠赠。

1.3 方法

1.3.1 浓缩集菌抗酸染色镜检[2]

嘱患者留取清晨起床漱口后从肺深部咳出的痰液1～2 mL，挑取脓样、干酪样部分，加入适量0.5% NaOH溶液，振荡混匀，于100 ℃沸水中加热30 min；取出后1 662×g离心15 min，弃上清，取沉淀物涂片，烘干后行抗酸染色镜检。结果判读：油镜下见红色杆状或分枝状抗酸杆菌，可报告阳性；如连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌，则报告阴性。

1.3.2 样本前处理

挑取约5 mL痰样本至50 mL离心管中，加等量2% N-乙酰半胱氨酸-NaOH溶液，旋涡振荡20 s，室温静置15 min，加无菌磷酸盐缓冲液（pH值6.8）至50 mL，886×g离心，15 min，弃上清，添加1～3 mL磷酸盐缓冲液（pH值6.8）以中和至pH值6.8。

1.3.3 双相培养[3]

痰样本进行前处理后，在中性罗氏培养基中加入1 mL Rpf培养液，制备成双相培养基，将处理后的0.5 mL痰样本加入双相培养管中，置于摇床上24 h，使含有样本的培养液均匀涂布在固体培养基斜面上，斜面朝上放入37 ℃恒温培养箱内培养。接种后每日观察固体培养基表面菌落生长情况和液体培养基浑浊情况。结果判读：液相成分中观察到培养液浑浊或颗粒样菌团悬浮，震荡后无明显变化，经涂片证实后，可记录为阳性结果；观察固体培养基上的菌落生长形态，鉴别非结核分枝杆菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）；8周后仍无细菌生长，记录为阴性结果。

1.3.4 Xpert MTB/RIF检测

将痰液收集在防漏收集容器中，将样本处理试剂（2∶1）加入样本中，盖上盖子，用力震荡10～20次，室温静置10 min，再次震荡10～20次使样本充分液化，静置5 min；使用专用无菌移液管吸取2 mL液化后的样本到检测匣加样孔中，关闭检测匣盖子，上机检测。检测结果由仪器自动判读。

1.3.5 T-SPOT检测

用肝素抗凝管采集患者空腹新鲜静脉血5 mL，加入Ficoll分离液分离单个核细胞，用细胞培养液配置成25万细胞/mL的标准溶液。在检测孔中加入50 µL CFP-10、ESAT-6抗原蛋白混合溶液，阴性孔加入50 µL细胞培养液，阳性对照孔加入50 µL植物血凝素，然后每孔加入100 µL配置好的细胞标准溶液，混匀后置于CO2培养箱中，37 ℃培养过夜，第2天用磷酸盐缓冲液洗脱3遍，加入生物标记的抗γ干扰素抗体50 µL，4 ℃孵育2 h，磷酸盐缓冲液洗脱干净后，行酶联显色，显微镜下记录斑点数。

1.4 统计学分析

采用Graphpad 7.0软件进行统计分析。计数资料以例/率表示，比较采用Fisher精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双相培养、T-SPOT、Xpert MTB/RIF、浓缩集菌抗酸染色镜检阳性检出率比较

双相培养阳性检出率（57.7%）显著低于T-SPOT（71.3%）（P<0.05）；稍高于浓缩集菌抗酸染色（41.7%）和Xpert MTB/RIF（53.6%），但差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 4种方法阳性检出率比较

2.2 抗酸涂片阴性时，双相培养、T-SPOT、Xpert MTB/RIF阳性检出率比较

175份临床确诊患者样本中，抗酸染色阴性102例，将其中61例样本行双相培养、T-SPOT、Xpert MTB/RIF检测，结果显示，双相培养检出率（35.0%）显著低于T-SPOT（65.6%）（P<0.001）；与Xpert MTB/RIF检出率（32.7%）比较，差异无统计学意义（P=0.99）。见图2、表2。

表2 抗酸涂片阴性样本3种方法阳性检出率比较

图2 抗酸涂片阴性样本3种方法阳性结果分布

2.3 抗酸染色和双相培养联合检测与T-SPOT和Xpert MTB/RIF阳性率比较

抗酸染色和双相培养技术联合阳性检出率为62.3%（109例），稍高于Xpert MTB/RIF阳性检出率（53.6%），略低于T-SPOT阳性检出率（71.3%），但差异均无统计学意义（P值分别为0.129、0.117）。

2.4 双相培养鉴别MTB和NTM感染比较

MTB和NTM在双相培养基中同时培养20 d的菌落形态见图3，MTB菌落在琼脂上呈现干燥菜花样典型的颗粒，NTM菌落不典型，较湿润、形态细小光滑，与普通细菌类似，而T-SPOT和Xpert MTB/RIF由于方法学的原因只能诊断MTB感染，无法诊断NTM感染。

图3 双相培养基MTB和NTM菌落形态

3 讨论

我国是结核病高负担国家之一，活动性肺结核及时准确的诊断仍是临床工作中最大的挑战。虽然抗酸染色、MTB培养、Xpert MTB/RIF和T-SPOT等技术可以用于诊断结核病[4-7]，但均存在局限。痰液直接涂片抗酸染色法是目前应用最广泛的实验室检测技术，虽然该技术快速、经济，但敏感性不高，而且显微镜镜检无法区分MTB和NTM；细菌培养是诊断结核病的金标准，也可以分析菌株耐药性，但耗时长；T-SPOT基于暴露于MTB特异性抗原的淋巴细胞分泌的γ-干扰素，已被用于诊断MTB感染[8-9]，且结果不受接种卡介苗和NTM感染的影响，在临床实践中用来代替结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST），但无法区分活动性结核病和潜伏性结核病[9-11]。Gene Xpert/RIF可同时检测MTB和利福平耐药相关突变基因，在人类免疫缺陷病毒感染等免疫抑制患者中循环阈值显著增加[12]。有研究发现，免疫抑制患者Xpert MTB/RIF敏感性和阴性预测值都较低[13]。

有研究证实了结核病患者痰样本存在非复制MTB[14]。非复制MTB在固体培养基上无法生长，这可能是MTB培养通常需要6～8周，甚至阴性的原因[15-16]。Rpf是细菌蛋白质家族，由MTB产生，可刺激分枝杆菌生长[17-18]，具有与溶菌酶相关的酶活性，可水解细菌细胞壁，能够使非复制MTB复苏。有研究发现，Rpf能水解MTB休眠菌的细胞壁肽聚糖，从而使MTB从休眠状态转变为活跃复制状态，且能在体外促进MTB休眠菌复苏[19-20]。痰中的非复制MTB被Rpf复苏，可以提高MTB培养的阳性率，缩短报阳时间[13]。有研究发现，在Rpf的刺激下，MTB菌落数是普通培养获得的菌落数的至少4倍[21]。本研究基于Rpf可以刺激痰样本中非复制MTB的生长原理，在中性琼脂培养基斜面上添加含有Rpf的液体培养基，制成双相培养基，结果显示，175例肺结核患者痰样本双相培养的阳性检出率为57.7%，明显高于浓缩集菌抗酸染色的阳性检出率（41.7%，P<0.05），略高于Xpert MTB/RIF5的阳性率（53.6%，P=0.503），但低于T-SPOT的阳性率（71.3%，P<0.05）。本研究结果显示，在抗酸染色阴性的样本中，双相培养阳性检出率为35.0%，低于T-SPOT（65.6%，P=0.001）；与Xpert MTB/RIF的阳性率（32.7%）相当（P=0.99）。这些数据进一步证实了在抗酸染色阴性活动性肺结核患者中，双相培养与Xpert MTB/RIF有着等效甚至略微的优势。我国结核病治疗任务和患者经济负担都较重，相对于治疗成本较高的Xpert MTB/RIF和T-SPOT，双相培养的成本只有其1/10，大大减轻了患者经济负担。而且，双相培养方法与抗酸染色一样，操作简便，不需要特殊仪器，为我国结核病筛查第一哨点的基层医院开展MTB检测提供了可能。本研究中，双相培养和抗酸染色联合检测的阳性检出率高达62.3%，超过了国家疾病预防控制中心关于结核病患者病原生物学阳性检出不低于50%的要求，且高于Xpert MTB/RIF阳性检出率53.6%，仅比T-SPOT的阳性检出率（71.3%）略低。同时，还能通过固相培养基中菌落的经典形态初步鉴别NTM，规避了Xpert MTB/RIF和T-SPOT无法检测NTM的不足。

结核病快速分子检测的优势在于其敏感性高、特异性强、检测时间短[22]。但Xpert MTB/RIF的缺点是仅能鉴定MTB，无法鉴别NTM；仅能检测RIF耐药与否，无法判断其他抗结核药物的敏感性；而且成本较高，我国大部分基层医疗机构尚无条件开展应用。

综上所述，本研究通过双相培养技术与抗酸染色联合应用，实现了在有限的医疗硬件平台达到与GeneXpert/RIF等效的检测效果，给肺结核的早期诊断提供了新的思路。