春砂仁精油对尼罗罗非鱼幼鱼生长、消化、抗氧化能力和血清生化指标的影响

李成辉，董宏标，郑晓婷，桂福坤，曾祥兵，明俊超，陈 飞，陈 健，张家松

1.浙江海洋大学/国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江 舟山 316000

2.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300

3.海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室，海南 陵水 572426

4.广东南湾水产有限公司，广东 阳江 529500

5.阳江市水产技术推广站，广东 阳江 529500

尼罗罗非鱼 (Oreochromisniloticus) 原产于非洲，属鲈形目、丽鱼科、罗非鱼属，具有食性杂、生长快、无肌间刺、肉质鲜美等优点，现已成为联合国粮农组织 (Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO) 向全球推广养殖的品种[1]。我国是世界上最大的罗非鱼生产和出口国，随着罗非鱼养殖集约化程度不断提高，生产上追求低成本和高产出[2]，长期高能量和较高比例植物蛋白饲料的过度投喂可能导致鱼体出现如脂质蓄积、肠道抗氧化能力下降等不良症状[3-4]。此外，病原、霉变饲料、污染物或抗生素等均会造成鱼体肠道黏液层损伤，使得共生和病原微生物直接接触肠上皮，进而诱导肠道组织损伤[5-8]。因此，改善鱼类肠道健康和促进鱼类消化及脂质代谢能力可从根本上助力罗非鱼集约化养殖的发展。

春砂仁 (Amomumvillosum) 是广东省阳春市的地方特色产品，著名“四大南药”之一，其味辛、性温且芳香，具行气调中、和胃醒脾和化湿消滞的功效[9-10]。中医上常用于治疗胃肠疾病，其主要功能成分为其中的天然挥发油，且砂仁茎叶中的挥发性成分与砂仁果实中的相似。大量研究表明天然植物精油在抗氧化、抗炎、降血脂、促进伤口愈合和提高机体免疫力等方面疗效显著[11-14]。已有研究发现，春砂仁精油能提高大鼠 (Rattusnorvegicus) 溃疡愈合百分率，显著增强血清的抗氧化能力[15]；促进功能性消化不良大鼠的胃排空[16]；抑制胃癌细胞的生长并诱导其凋亡[17]。此外，春砂仁精油还能够有效抑制大鼠内源性脂质的合成，降低血清脂质水平，预防脂肪肝的形成[18]。

目前，春砂仁精油在水产动物中尚未见相关的应用报道。本研究通过拌喂不同剂量的春砂仁精油，探究其对罗非鱼幼鱼生长性能、消化能力、肠道抗氧化能力、血清肝功能和脂质代谢指标的影响，以为春砂仁在水产动物中的应用提供实验依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

实验用春砂仁精油由阳江市百盛园实业有限公司提供，为春砂仁茎叶抽提物，其主要成分如表1 所示 (送检，中国广州分析测试中心，GC-MS法)。实验用基础饲料为淡水鱼膨化配合饲料 (江门海大饲料有限公司)。将春砂仁精油称质量后添加蒸馏水至15 mL 振荡成乳液，混匀后用高压喷壶按每公斤饲料 0、2.0、4.0 和8.0 g 的剂量均匀喷涂于基础饲料表面 [最终含水率 (w)≤11.0%]，密封盒盛放，每日投喂前现配现用。

表1 春砂仁精油化学成分Table 1 Main chemical composition in essential oil of A.villosum

1.2 实验设计与养殖管理

实验用罗非鱼幼鱼的获取、暂养和养殖均于广东南湾水产有限公司 (广东阳江) 进行。暂养2 周后，随机选取体表无损伤、规格相近的健康罗非鱼幼鱼480 尾 [(20.34±2.08) g]，分为 4 组，即对照组(0 g·kg-1)、低剂量 (2 g·kg-1)、中剂量 (4 g·kg-1) 和高剂量组 (8 g·kg-1)，每组 4 个重复，每个重复 30 尾鱼，室内饲养于16 个300 L 的黑色圆桶中，养殖实验为期8 周，分别投喂对应剂量饲料，日饱食投喂1 次 (9:00) 并记录投喂量 (投喂30 min 后通过50 目筛网回收残饵，70 ℃烘干，残饵量用饲料溶失率校正，测定溶失率时随机在6 个无鱼的缸中各放入1 份称好的饲料，30 min 后回收，70 ℃烘干至恒质量后称质量，溶失率为4.29%)。暂养和养殖期间为自然光周期，日换水量为30% (11:00)，水温 (27±2) ℃ (期间通过暖风机根据实际温度调整)，溶解氧质量浓度≥4.5 mg·L-1(气石增氧)，pH 为7.8±1，氨氮质量浓度≤1 mg·L-1，亚硝酸盐质量浓度≤0.02 mg·L-1。

1.3 样品采集

在养殖实验结束后测量和取样，操作前停喂1 d，每个重复组随机取6 尾实验鱼，经300 mg·L—1MS-222 浸泡麻醉后，测其体长和体质量；随后使用 1.5 mL 无菌注射器从尾静脉取血 (混合全血样品在4 ℃下静置1 h，待血液分层后，3 000 r·min—1离心10 min，收集血清于1.5 mL 离心管，-80 ℃保存)，用于血清生化指标分析；将实验鱼置冰盘上剖取胃和肠道组织于2 mL 离心管中，-80 ℃保存，用于消化酶和肠道抗氧化能力分析。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长指标测定

依照以下公式计算体质量增长率 (Weight gain rate,RWG,%)、特定生长率 (Specific growth rate,RSG,%·d-1) 、摄食率 (Feeding rate,RF,%)、肥满度(Condition factor,CF,g·cm-3) 和饵料系数 (Feed conversion ratio,FCR)。

式中：Wt和W0分别为罗非鱼幼鱼的终末和初始体质量；t为实验时间 (56 d)；L为鱼体长 (cm)；F为饲料摄入量 (g)。

1.4.2 血清生化指标测定

血清中总蛋白 (TP)、球蛋白 (GLOB)、碱性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-CH) 和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-CH) 等指标，采用专用试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司) 于全自动生化分析仪 (BS200) 检测。

1.4.3 消化道抗氧化指标和消化酶的测定

每个组织样品取0.1 g 与0.9 mL 的PBS 缓冲液混合制成匀浆，3 500 r·min—1、4 ℃离心10 min 后取上清液分别测定胃蛋白酶 (Pep)、胃淀粉酶 (GAMS)、肠淀粉酶 (I-AMS) 和肠脂肪酶 (LPS) 等消化酶指标，以及总抗氧化能力 (T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 和丙二醛 (MDA) 等肠道抗氧化指标，所有指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒参照说明书进行测定。

1.5 数据分析与处理

实验数据以“平均值±标准差 ()”表示，用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，Tukey's 法进行多重比较，显著性水平设为P<0.05。

2 结果

2.1 春砂仁精油主要化学成分分析

采用 GC-MS 法从春砂仁茎叶精油中共测出化合物25 种 (表1)，主要为烯萜类、醇类、醛类和酮类化合物，其中含量最高的是β-蒎烯 (44.67%)，其次是α-蒎烯、桧烯、柠檬烯等烯萜类物质。

2.2 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼生长的影响

如表2 所示，与对照组相比，各处理组罗非鱼幼鱼终末体质量、终末体长、体质量增长率和特定生长率均有所升高，且随精油添加剂量的增加，呈先升后降的趋势，而饵料系数呈先降低后升高的趋势，其中低剂量组各项生长指标均显著优于其他组(P<0.05)。

表2 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼生长的影响Table 2 Effect of A.villosum essential oil on growth performance of tilapia

2.3 春砂仁精油对罗非鱼消化酶的影响

如图1 所示，低剂量组罗非鱼幼鱼各项消化酶指标均显著高于其他组 (P<0.05)，而其余组间差异不显著。随着精油添加剂量的增加，胃蛋白酶(Pep) 活性呈先升后降的趋势；胃淀粉酶 (GAMS)、肠淀粉酶 (I-AMS) 和脂肪酶 (LPS) 活性则呈先升再降后升的波动趋势。

图1 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼消化酶的影响注：字母不同表示同一时间各实验组之间存在显著性差异 (P<0.05)。后图同此。Fig.1 Effects of A.villosum essential oil on digestive enzymes of juvenile tilapiaNote: Values with different letters represent significant differences at the same time (P<0.05).The same case in the following figure.

2.4 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼肠道抗氧化能力的影响

如图2 所示，随着春砂仁精油添加剂量的增加，各实验组罗非鱼幼鱼肠道中 T-AOC、SOD 和CAT 活性、GSH 浓度均呈先升后降的趋势，且低剂量组显著高于其他组 (P<0.05)；MDA 浓度随精油剂量的增加呈降低趋势，且高剂量组显著低于对照组 (P<0.05)；其余各组肠道抗氧化指标与对照组均无显著性差异 (P>0.05)。

图2 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼肠道抗氧化指标的影响Fig.2 Effects of A.villosum essential oil on intestinal antioxidant capacity of juvenile tilapia

2.5 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼血清肝功能和脂质代谢指标的影响

2.5.1 对血清肝功能指标的影响

如表3 所示，随着春砂仁精油添加剂量的增加，各实验组罗非鱼幼鱼血清中TP、GLOB 含量、ALP 和ALT 活性均呈先降低后升高的趋势，其中，低剂量组TP 和GLOB 含量显著低于其他组(P<0.05)。其他处理组血清肝功能指标无显著性差异 (P>0.05)。

表3 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼血清肝功能指标的影响Table 3 Effects of A.villosum essential oil on liver function index in serum of juvenile tilapia

2.5.2 对血清脂质代谢指标的影响

如表4 所示，随着春砂仁精油添加剂量的增加，各实验组罗非鱼幼鱼血清中TG、TC、HDLCH 和LDL-CH 含量均呈先降后升的趋势，其中，低剂量组T C 和L D L-C H 显著低于其他组(P<0.05)，且高剂量组HDL-CH 显著高于对照组(P<0.05)。其他处理组血清指标无显著性差异(P>0.05)。

表4 春砂仁精油对罗非鱼幼鱼血清脂质代谢指标的影响Table 4 Effects of A.villosum essential oil on lipid metabolism index in serum of juvenile tilapia

3 讨论

3.1 春砂仁精油主要成分与功能

现代药理学研究已经证实，砂仁具有保护胃肠、抗炎、止痛、止泻、抗菌和降血糖等作用[19-20]。考虑春砂仁果实应用于实际生产中成本较高的因素，本实验采用春砂仁茎叶抽提挥发油，经检测分析，其主要成分为β-蒎烯、α-蒎烯和桧烯等，虽未检测出砂仁果实挥发油中所含有的主要成分乙酸龙胆酯[21]，但其他功能成分均有检出。临床验证表明，α-蒎烯和β-蒎烯具有抗凝血、抗肿瘤、保护胃肠道、抗炎镇痛和抗氧化等诸多功效[22-24]。Salas-Oropeza 等[25]研究发现α-蒎烯能够提高伤口愈合活性，加速皮肤伤口闭合并产生具有良好抗拉强度的疤痕。Santos 等[26]研究证明β-蒎烯对糖尿病大鼠有降血糖、降血脂和抗炎的作用。说明实验用的春砂仁茎叶挥发油同样具有抗氧化、保护胃肠道、抗炎和促进糖脂代谢等诸多功能。

3.2 春砂仁精油可提升罗非鱼幼鱼生长和消化能力

促消化是春砂仁精油肠胃保健功能的直观体现。有研究发现10 g·kg-1的砂仁醇水提物在十二指肠给药下有利于大鼠胆汁的分泌[27]。Jucá 等[28]亦报道α-蒎烯和β-蒎烯能够促进大鼠胃窦组织P 物质 (Substance P) 与胃动素的释放，加速大鼠胃和小肠的排空。邢莲影等[29]研究发现砂仁叶油和砂仁水煎剂的作用一致，具有推进小肠运动的作用。本研究结果表明，低剂量 (2 g·kg-1) 处理组罗非鱼幼鱼胃中Pep、AMS 和肠中LPS、AMS 的活性相比于对照组均显著升高 (P<0.05)，而中剂量 (4 g·kg-1)和高剂量 (8 g·kg-1) 处理组则无显著性差异，说明拌喂适量的春砂仁精油能够提高罗非鱼幼鱼的消化能力。

消化能力的提升有助于机体对营养的吸收，进而促进代谢和生长[30]。本研究发现，春砂仁精油添加水平在2～8 g·kg-1时，罗非鱼幼鱼的终末体长、终末体质量、体质量增长率和特定生长率均呈先升后降的趋势，而饵料系数则呈先降后升的趋势，其中添加水平在2 g·kg-1时效果最佳，说明适量春砂仁精油能明显改善罗非鱼幼鱼的生长状况和饲料转化利用率。推测这与低浓度的春砂仁精油保护肠道组织结构完整，促进消化酶的分泌有关，进而提高了机体对营养物质的吸收和利用。有研究表明，春砂仁精油通过抑制三羧酸循环 (TCA)，减少三磷酸腺苷 (ATP) 和活性氧 (ROS) 的产生以及增强SOD 活性来诱导细菌死亡[31]，推测中高浓度的春砂仁精油可能会破坏肠道菌群结构，引起致病菌感染，进而限制罗非鱼的生长及消化能力。

3.3 春砂仁精油可提高罗非鱼幼鱼肠道抗氧化能力

普遍认为，植物精油具有抗氧化作用，常通过清除自由基、螯合金属离子、抑制细胞膜脂质过氧化和调节氧化酶等途径来实现[32-36]。T-AOC 从总体上反映了组织对自由基和活性氧类物质的抵抗能力[37]，GSH 是细胞中重要的非酶内源性抗氧化剂[38]，而MDA 是脂质过氧化的次级产物，被用作细胞膜损伤的指标[39]。SOD 和CAT 是两种关键的抗氧化酶，起到清除活性氧自由基的作用[40]。本研究低剂量组中较高水平的SOD 和CAT 活性表明适量的春砂仁精油能够提高抗氧化酶的活性，T-AOC和GSH 水平的升高说明其能够提高罗非鱼幼鱼肠道的抗氧化和清除自由基能力。研究表明，柠檬烯和芳香醇等萜烯类物质暴露在空气中形成的氧化产物会导致接触性过敏[41]，而过敏反应中会伴随组织细胞ROS 含量升高[42]。本研究中低剂量组MDA浓度未下降，推测可能是低剂量精油中部分萜烯类物质氧化导致其清除肠道组织 ROS 的能力受限，而肠道MDA 浓度随着精油剂量的增加而降低，推测这与高剂量春砂仁精油发挥自身清除ROS 的能力有关，进而导致细胞膜脂质过氧化程度降低。

3.4 春砂仁精油可改善罗非鱼幼鱼血清肝功能指标和脂质代谢能力

鱼类血清肝功能指标能反映鱼类肝脏的生理状态和病理情况[43-45]，血清TP 由白蛋白 (ALB) 和GLOB 组成，ALB 主要由肝脏合成，GLOB 则由B 淋巴细胞合成[46-47]。有研究表明，春砂仁精油能够改善小鼠的血清肝功能指标，降低AST 和ALT 活性，改善衣霉素诱导的肝脏脂质积累[18,48]，推测低剂量的春砂仁精油可能通过促进脂质代谢，减少肝脏脂质累积，进而改善肝功能。本研究中，低剂量组罗非鱼幼鱼血清中的TP 和GLOB 含量较对照组显著降低，ALP 和ALT 活性较对照组呈下降趋势。

血脂水平的高低与机体脂质代谢能力密切相关[49]。血清TC 浓度是评价机体脂质代谢能力的重要指标[50]，高密度脂蛋白 (HDL) 在血液中携带胆固醇后形成HDL-CH，由血液向肝脏输送，是机体组织胆固醇的“清洁剂”，其含量越高，机体将胆固醇运回肝脏中的能力就越强，而低密度脂蛋白(LDL) 则携带胆固醇形成LDL-CH，由肝脏向血液输送[51]。本实验中，低剂量组罗非鱼幼鱼血清中TC 和LDL-CH 的水平显著低于其他组 (P<0.05)，且随着春砂仁精油添加剂量的增加，HDL-CH 的水平逐渐升高。这表明饲料中添加适量春砂仁精油具有促进脂质代谢的功效。

4 结论

拌喂适量的春砂仁精油能显著增强罗非鱼幼鱼的消化和肠道抗氧化能力，提升脂质代谢水平，改善血清肝功能指标，进而提高罗非鱼幼鱼的生长性能。在本实验条件下，春砂仁精油的适宜添加剂量为2 g·kg-1。