猪病毒性腹泻灭活疫苗对仔猪保护力研究

何玲，钟采灵，王凤国，梁桂益，麦凯杰，孙华，陈瑞爱，3，黄红亮,3*

（1.广东温氏大华农生物科技有限公司 广东云浮 527400；2.广东精捷检验检测有限公司 广东云浮 527400；3.广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室 广东肇庆 526238）

自2011 年底，由猪流行性腹泻病毒（porcine diarrhea virus，PEDV）GⅡ群引起的猪流行性腹泻（PED）在我国河南暴发以来，PEDV GⅡ快速蔓延至全国各大小猪场，目前已成为危害养猪业的三大传染病（ASF、PRRS、PED）之一。该病主要危害新生仔猪，临床表现为呕吐、水样腹泻、脱水、消瘦、死亡，以7 日龄内仔猪发病最为严重，发病率与死亡率可高达100%[1]。生长育肥猪感染后偶有发病，死亡率低[2]，但可能长期排毒，是猪场发病的病毒来源之一。对于PED 的防控，疫苗免疫是比较经济实惠的手段。

猪流行性腹泻病毒属冠状病毒科（coronaviridae）冠状病毒属（coronavirus）[3]，核酸为线性单股正链RNA，基因组约为28 kb，病毒粒子大小约为90～195 nm。PEDV 基因组编码的结构蛋白包括纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）[4]。纤突蛋白（S）为主要的免疫原性蛋白，能诱导高水平的保护性抗体。

为了给客户提供更加安全高效的产品，本研究小组坚持持续对猪病毒性腹泻灭活疫苗产品进行改进升级。目前通过提升抗原含量、保存抗原完整免疫原性及优化佐剂等，并评价其对仔猪的保护效力，结果表明其免疫效力显著提升，表明大华农公司将为客户提供更加优质的产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）疫苗：竞品1 与竞品2 是从市场购买的同类产品；止泻威1、止泻威2 由广东温氏大华农生物科技有限公司提供。

2）细胞及主要试剂：Vero 细胞为本实验室保存，DMEM 培养基、胰蛋白酶和胎牛血清公司为Gibco 产品。

3）试剂盒：IgA 试剂盒为IDEXX 产品。

4）实验动物：怀孕70 日龄一胎母猪（二元杂），从新兴某种猪场购得。

5）攻毒毒株：MJ 毒株，P5 代，由广东温氏大华农生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1）试验分组：试验分组与免疫方案如表1。

2）攻毒方案：对止泻威1、竞品1、竞品2 免疫组及对照组所产5～7 日龄哺乳仔猪进行攻毒，攻毒剂量为105.0TCID50/头，攻毒方式为口服。

3）中和试验：①生长良好的Vero 细胞用胰蛋白酶消化，用DMEM 生长液分散后，稀释至5～8×105个/mL，最后将细胞加入96孔板中，0.1 mL/孔，96 孔板置于37℃、5% CO2培养；②待96 孔板中Vero 细胞生长至致密，用DMEM 培养液洗涤细胞3 次，200 μL/孔/次，最后加入含适量胰蛋白酶DMEM 培养液，100 μL/孔；③用DMEM2 倍系列稀释血清或乳汁至210，分别取100 μL 与100 μL 病毒液（1 000 TCID50/mL）混合，置于37 ℃、5% CO2孵育1 h，每个稀释度重复4 次；④去除步骤②中96 孔板中培养液，每孔加入200 μL 血清或乳汁稀释液与病毒混合液，置于37 ℃、5% CO2孵育1 h 后，弃除，用DMEM 培养液洗涤细胞3 次，200 μL/孔/次，最后加入含适量胰蛋白酶DMEM 培养液，200 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培养5～7 d；⑤同时设病毒对照和阴性血清对照；⑥每日观察细胞病变效应（CPE）；⑦50%血清中和终点的计算：50% 细胞不产生细胞病变（CPE）的血清稀释度。根据细胞病变程度，用Reed-Muench 法计算50%血清中和滴度。

4）抗体检测：IgG 抗体与IgA 抗体检测按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 抗体检测结果

1）血清中和抗体：该批母猪为一胎母猪，免疫前抗体小部分母猪为阳性（见图1 中免疫前中和抗体结果）。将母猪随机分组进行2次免疫后，在二免后2 周，从诱导血清中和抗体水平（见图2）来看，止泻威诱导中和抗体高于400，最高达512，且离散度低（小于10%），显著优于同时对比的两个竞品。

图1 母猪血清中和抗体水平

图2 初乳中SIgA 抗体水平

2）初乳中SIgA 抗体：采集产仔当天的乳汁（初乳），用IDEXX试剂盒检测其中的SIgA 抗体，从检测结果（见图2）可以看出，止泻威诱导了高水平SIgA 抗体，显著高于两个竞品。

3）初乳中和抗体：通过检测初乳中和抗体（见图3）发现，止泻威免疫后诱导的中和抗体平均值达400 以上，最高可达512，显著高于两个竞品。

图3 初乳中和抗体水平

2.2 哺乳仔猪被动保护

在仔猪哺乳5～7 d，采用野毒MJ 株对其进行攻击，每头仔猪口服105TCID50。在攻毒后24～48 h，对照组、竞品1 组、竞品2 组仔猪均出现不同程度呕吐、腹泻，止泻威组在攻毒后3～5 d 仅个别仔猪出现轻微腹泻，各组仔猪腹泻率、存活率及存活弱仔率见表2。综合腹泻发病率、存活率及存活弱仔率，止泻威的保护效果显著高于两个竞品。

表2 哺乳仔猪攻毒后发病统计表

3 讨论与结论

目前市售的疫苗主要有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗两类疫苗，近几年为PED 的防控做出了巨大的贡献。但是活疫苗免疫后能不同程度地排毒，排毒时间不一，增加猪场环境中的病毒载量，且活疫苗免疫后，猪只带毒时间长，虽然在配怀舍，不排毒，但进入产房后可能迅速排毒，导致初生仔猪感染发病[5]。采用传统工艺制备的病毒性腹泻灭活疫苗，抗原含量有限（108.0～9.0TCID50/mL），且常用的灭活剂能一定程度地破坏抗原表位，导致免疫原性降低（数据未发表），因此，病毒性腹泻灭活疫苗的免疫效力仍有提升的空间。

本研究小组通过工艺改进有效提高了PEDV 有效抗原含量，达200 μg/mL，且筛选到能完整保留病毒结构的灭活剂，以此制备的疫苗经本研究评估验证，无论从二免疫后2 周血清中和抗体、初乳中SIgA 抗体及初乳中和抗体三项指标评价，还是从哺乳5～7 d初生仔猪的攻毒保护（仔猪腹泻率、存活率及存活弱仔率）评价，猪病毒性腹泻灭活疫苗免疫效力显著优于竞品疫苗，初生哺乳仔猪能获得更优于竞品疫苗的被动保护。■