中国与日本抹茶氨基酸指纹图谱的构建及差异性分析

武蓓琪，白志文，王 闪，汪 璐，田应刚，王洪新,3*

1. 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2. 贵州贵茶（集团）有限公司，贵州 铜仁 554400；3. 国家功能食品工程技术研究中心（江南大学），江苏 无锡 214122

抹茶起源于中国魏晋时期，兴于唐朝，于宋朝进入鼎盛期[1]。抹茶是选用经过遮阴覆盖技术栽培的茶树鲜叶经蒸汽杀青、干燥、研磨等工艺加工成碾茶，然后用天然石磨或合金球磨机研磨制成的粒径在10 ～ 20 μm 的茶叶产品[2]。茶树遮阴后有利于鲜叶中以茶氨酸为代表的有甘甜滋味的氨基酸成分的积累和保留，同时减少具有强苦涩味的儿茶素和咖啡因的生成[3]。碾茶作为制作抹茶的关键中间原料之一，直接关系到抹茶的品质。选用不同产地或品种的碾茶制得的抹茶中氨基酸组成和含量的差异会直接影响抹茶的香气和滋味[4]。因此，碾茶的挑选成为制作品质优良抹茶的关键。‘福鼎大白茶’和‘龙井43’是贵州茶区引种的用于抹茶生产的两个绿茶品种，其鲜叶中氨基酸、叶绿素和蛋白质含量高，咖啡因和儿茶素含量低，特别适合作为抹茶产品的原料[5]。抹茶属于未经发酵的超微绿茶粉，有利于作为健康型配料在各种食品中添加应用，同时与普通绿茶相比更容易被人体吸收，具有较高的营养价值与药用价值[6]。

化学成分的特征指纹图谱技术已被应用于茶叶和其他食品领域的品质评价和鉴定中。凌彩金等[7]用SPSS 软件建立了不同采摘季节‘英红九号’红茶的主要生化成分的指纹图谱，为识别不同季节的红茶提供了指导依据。王淑慧等[8]建立了信阳毛尖茶汤滋味的HPLC 特征指纹图谱，对茶汤的滋味成分进行了直观的分析，明确了不同等级茶叶的差异性，为绿茶的质量监控建立了一种科学量化的方法。王世博等[9]建立了白茶的儿茶素类和生物碱类成分的特征指纹图谱，为白茶的质量控制和深度开发提供参考依据。但到目前为止，未见有关抹茶氨基酸指纹图谱的相关研究报道。

目前，用于茶叶氨基酸分析的方法主要有氨基酸自动分析仪[10]、气相色谱-联用质谱法[11]、高效液相色谱仪[12]、超高效液相色谱-串联质谱法[13]等，其中高效液相色谱法是应用最广泛的检测方法。由于大多数氨基酸无紫外吸收也无荧光发射的特性，需要采用氨基酸衍生化来提高分析检测的灵敏度和分离选择特性[14]。柱前衍生化方法与氨基酸自动分析仪采用的柱后衍生化相比具有分析时间短、灵敏度高和适用范围广等优点被更广泛采用[15]。

本试验以我国贵州生产的16种抹茶为原料，通过检测其酸水解氨基酸以及游离氨基酸的组分和含量，重点关注茶氨酸的含量区别，通过SPSS 和Origin 8.5 软件进行数据处理及绘制指纹图谱并对呈味氨基酸成分进行分析，同时和日本6 个品牌的抹茶对比分析，重点分析贵州抹茶呈味的独特性。本文具有较好的指导贵州抹茶的辨伪识别、选择原料、优化制作工艺以及促进市场开拓的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

16 个抹茶试样均来自贵州贵茶集团（表1），6个日本抹茶样通过国际物流购买于日本（表2）。测定前密封保存在4℃冰箱中待用。

表1 贵州抹茶试样情况Table 1 Information of Guizhou Matcha samples

表2 商品抹茶试样清单Table 2 Information of purchased Matcha samples

1.2 仪器与设备

AR224CN 分析型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；DFT-100 高速万能粉碎机，上海皓庄仪器有限公司；HH-4 数显搅拌水浴锅，常州赛普实验仪器厂；GZX-9140MBE 电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DL-5-B 离心机，上海安亭科学仪器厂；YQ 型超声波清洗机，上海易净超声波仪器有限公司；Agilent Ag1100 高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.3 主要试剂

盐酸、醋酸、3-巯基丙酸、氢氧化钠、乙酸钠、三乙胺、四氢呋喃均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；邻苯二甲醛（OPA）衍生化试剂、氯甲酸芴甲酯（FMOC）衍生化试剂（美国Agilent 公司）；乙腈、甲醇均为色谱级（国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 试验方法

采用HPLC 法分析氨基酸的组成，含量通过外标法测定。由于氨基酸极性大，且无紫外吸收，故需要进行OPA-FMOC 柱前衍生化处理[15]。

1.4.1 游离氨基酸样品前处理

精确称量1.0 g 样品至15 mL 试管中，加入10 mL 沸水超声30 min，然后在15 000 r/min 条件下离心15 min，过0.22 μm 水膜，取400 μL上清液于液相进样品中待测。

1.4.2 酸水解氨基酸样品前处理

称取100 mg 样品于密封的水解管中，加入8 mL 的6 mol·L-1HCl，通入3 min 氮气，使溶液呈微沸状态，密封水解管，放入烘箱，在120℃下水解22 h。加入4.8 mL 的10 mol·L-1NaOH 中和至pH 为7.2，蒸馏水定容至25 mL，双层滤纸过滤后在15 000 r/min 条件下离心30 min，过0.22 μm 水膜，取400 μL 上清液于液相进样品中待测。

1.4.3 试剂配置及色谱条件

流动相A：称取8 g 乙酸钠，加1 000 mL蒸馏水溶解，再加入225 μL 三乙胺，用5%的醋酸调节pH 至7.2，加入5 mL 四氢呋喃，混合后备用。

流动相B：称取8 g 乙酸钠，加400 mL 蒸馏水溶解，用2%醋酸调节pH 至7.2，将此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后备用。

色谱条件：根据谢至茹等[16]的方法，略作修改。色谱柱：ODS Hypcrsil-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；柱 温：40 ℃；检 测 波 长：338 nm、262 nm（脯氨酸）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。梯度洗脱。

1.5 数据统计与分析

每个样品重复测定三次，数据通过SPSS Statistics 19 软件（IBM，美国）进行分析。根据Tukey 检验，p＜ 0.05 表示差异显著。通过Origin 8.5、SPSS Statistics 19 分别绘制碾茶、抹茶的游离氨基酸和酸水解氨基酸的指纹图谱，根据SPSS 系统聚类方法进一步做聚类分析。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸的指纹图谱

由表3 可知，贵州16 种抹茶的游离氨基酸含量为0.60 ～ 2.58 g/100 g，大都低于日本抹茶的游离氨基酸含量（2.71 ～ 5.03 g/100 g），其中15 号贵州抹茶游离氨基酸含量与20 号日本抹茶接近。经色度仪测定，结果显示15 号抹茶的绿色度是最高的。

表3 17 种游离氨基以及茶氨酸含量Table 3 Contents of 17 free amino acids and theanine g / 100 g

抹茶中的氨基酸含量一般高于普通的绿茶，主要是抹茶的栽培管理中遮阴技术影响茶树氮代谢，增加抹茶中氨基酸的含量[17]。16 个贵州抹茶样游离氨基酸含量有明显差异，这可能主要是因为遮阴覆盖措施的差异[2]。由于遮阴成本较高，国内很多企业在茶树栽培过程中没有采用遮阴措施。茶树品种的不同是另一个主要原因。另外，茶树种植的不同地理环境有很大关系，高纬度和高海拔地区的茶树品种氨基酸含量高于低纬度和低海拔地区[18]。一般认为，纬度36°地理带附近种植的茶叶最适宜抹茶制作。‘福鼎大白茶’是贵州引种的主要茶树品种，虽然地处纬度较低，但较高海拔的贵州栽培出来的‘福鼎大白茶’鲜叶中氨基酸含量高，适合作为抹茶的原材料[19]。而日本抹茶大多数采用‘薮北种’茶鲜叶作为原料[6]，种植的地区纬度高于我国贵州，有利于茶鲜叶中蛋白质、氨基酸等含氮物质的积累[20]。

由图1 可知，茶氨酸（Theanine）和谷氨酸在贵州抹茶中所含比例较大，其次是天冬氨酸和精氨酸等。氨基酸的相对位置和相对含量大小可以对抹茶样品进行分类和品种分析。具体来说，图1 中16 个贵州抹茶的游离氨基酸的相对位置都一致，只是相对含量有差异，其中15号抹茶游离氨基酸含量明显高于其他抹茶，可能原因是遮阴的条件及采收的时间不同。

图1 贵州抹茶样游离氨基酸指纹图谱Figure 1 The fingerprint of free amino acids in Matcha from Guizhou

2.2 贵州抹茶聚类分析

为了进一步分析比较16 种贵州抹茶在游离氨基酸指标上的异同，在上述指纹图谱基础上，将18 种氨基酸含量为聚类变量，利用SPSS Statistics 19 软件中的组间连接法对16 个抹茶样品进行聚类分析（图2）。结果表明，16 种贵州抹茶样品被分成了三类。15 号为第一类；4、5、8、9、12、13 号 为 第 二 类；1、2、3、6、7、10、11、14、16 号为第三类。15 号样品中茶氨酸（1.42 g/100 g）和游离氨基酸总量（2.58 g/100 g）远高于其他样品，所以被分为单独的一类。剩下的15 个贵州抹茶样品的氨基酸仅在含量上有差异，氨基酸组成一致，差异较小，第二类的6 个抹茶样品游离氨基酸平均含量（0.86 g/100 g）小于第三类的9 个抹茶样品（1.38 g/100 g）。

图2 基于抹茶游离氨基酸含量的聚类分析Figure 2 Cluster analysis based on content of amino acids in Matcha

在聚类分析的基础上，从三大类中各挑选一个游离氨基酸含量最高的样品作为代表和日本抹茶对比，绘制对比指纹图谱（图3）。

图3 贵州抹茶和日本抹茶游离氨基酸指纹图谱Figure 3 The fingerprint of free amino acids in Matcha from Guizhou and Japan

由图3 可知，日本抹茶的游离氨基酸含量普遍高于贵州抹茶，尤其是天冬氨酸、茶氨酸、谷氨酸和精氨酸的含量，但15 号贵州抹茶的茶氨酸含量接近20 号日本抹茶。同时，贵州抹茶的谷氨酸含量高于精氨酸，而日本抹茶则相反，说明日本抹茶和贵州抹茶在呈味方面表现不同。

2.3 茶氨酸含量差异

茶氨酸作为茶叶中的特殊氨基酸，约占茶叶中游离氨基酸的50%以上，是绿茶中含量最高的游离氨基酸，也是茶树中具有重要生理活性的次生代谢产物，对于茶叶品质与风味的形成至关重要[21]。22 个抹茶样品的茶氨酸含量见图4，不同小写字母表示抹茶试样之间差异显著（p＜ 0.05）。

图4 抹茶中茶氨酸含量Figure 4 Contents of theanine in Matcha

从表3 可知，贵州抹茶茶样茶氨酸含量占游离氨基酸总量的50%以上，与相关研究报道的结论一致[7]。但日本抹茶的茶氨酸含量没有达到总游离氨基酸的50%，其中17 号样的茶氨酸仅占总游离氨基酸的36%。从图4 可看出，贵州抹茶的茶氨酸含量差异较大，其中15 号抹茶的茶氨酸含量最高，为1.419 3 g/100 g，是4号抹茶（0.275 8 g/100 g）的5.15 倍，可能原因是茶叶的产地差异。4 号抹茶原料来自贵州黔南和铜仁的‘福鼎大白茶’，而15 号抹茶是采用来自贵州遵义的‘福鼎大白茶’。此外，不同的遮阴时间和方式可能也是造成茶氨酸含量差异的主要原因之一[22]。

2.4 水解氨基酸指纹图谱

所有样品都检出17 种水解氨基酸（表4），色氨酸未被检出，这是因为色氨酸在酸水解过程中被分解[23]。

表4 抹茶样品中17 种水解氨基酸含量Table 4 Contents of 17 free amino acids and theanine in Matcha samples g / 100 g

由表4 可知，谷氨酸的含量最高，约占水解氨基酸总量的20%；其次是天冬氨酸，占水解氨基酸总量的10%以上。该结果略高于赵明明等[24]的研究，证明遮阴可以提高绿茶中水解氨基酸的含量。同时，日本抹茶的平均水解氨基酸含量（27.07 g/100 g）高于贵州抹茶（22.14 g/100 g）。说明茶叶中蛋白质含量与产地、茶树品种等有一定的联系[25]。

绘制水解氨基酸指纹图谱（图5）可知，谷氨酸在抹茶中所占比例最大，其次是天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸等。贵州抹茶原料都来源于‘福鼎大白茶’，所以氨基酸排列顺序基本一致，没有太大变化，仅是含量差异。

图5 贵州抹茶样品的水解氨基酸指纹图谱Figure 5 The fingerprint of hydrolyzed amino acids in Matcha from Guizhou

2.5 呈味氨基酸指纹图谱

氨基酸组成和含量直接影响抹茶的味觉特征，如鲜味、甜味和苦味。氨基酸的鲜爽味能够有效降低茶汤的苦涩味，而茶氨酸、谷氨酸和天冬氨酸是构成茶叶鲜爽滋味的重要成分[26]。根据水解氨基酸的呈味特质，可以分为三类：一是鲜味氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸；二是苦味氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸；三是甜味氨基酸：丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和苏氨酸[27]。

由图6 可知，贵州抹茶的呈味氨基酸组成一致，含量因为茶叶个体差异而出现显著性差异；其中鲜味氨基酸的占比最大，直接证明了氨基酸是导致抹茶鲜爽滋味的关键物质。同时，谷氨酸的含量最高并且标准偏差较大（0.47%），所以谷氨酸可能是区分贵州抹茶和其他抹茶的重要指标[24]。6 号抹茶样和15 号抹茶样的谷氨酸含量明显高于其他试样，由此可推断这两个试样的鲜味更加明显。此外，日本抹茶的呈味氨基酸的排列顺序和贵州抹茶没有差异但含量明显高于贵州抹茶，表明日本抹茶更具鲜爽滋味，可能是茶树品种、遮阴技术以及生长环境等存在显著差异[22]。

图6 不同抹茶呈味氨基酸指纹图谱Figure 6 The flavor amino acids fingerprint of different Matcha

3 结论

测定并制作的抹茶氨基酸指纹图谱表明茶氨酸和呈味氨基酸可以作为贵州抹茶特征识别的依据。15 号抹茶总游离氨基酸含量明显高于其他抹茶，十分接近日本抹茶，适合作为高档抹茶的原料。贵州抹茶的茶氨酸含量占比高于日本抹茶，揭示其保健性功能可能会更好，在呈味方面也表现出更鲜的特点。后续需要继续扩大样本量并深入研究抹茶原料品种、遮阴方式、采摘季节、加工工艺以及存放时间等对氨基酸指纹图谱的影响，建立互相影响的关系模型，以便更好地指导高品质抹茶的生产。