茶提取物复合方对眼致病菌的抑制作用研究

李史仪，陆显格，湛水秀，郝志龙，余文英*

1. 福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002；2. 福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002；3. 植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室，福建 福州 350002

近年来，由于人们高强度、高频率使用电脑、电视与手机等视频终端产品及昼夜使用空调，患有不同程度干眼症的人的数量逐年上升，患病率为17% ～ 33%[1]。干眼症（Dry Eye Syndrome，DES；或Xerophthailmia），因眼球表面水分、豁液和脂质分泌不足造成泪液质、量及动力学的异常，引起泪膜不稳定及眼表面的损害，从而表征为视久疲劳、眼酸胀、干涩无泪及异物感等[2]。干眼症常与结膜炎、睑缘炎并发，主要表现为眼干涩引起的泪液分泌量减少以及泪液杀菌成分的变化，进而加重眼睛感染的概率，产生结膜炎、睑缘炎等轻中度炎症；而反过来，慢性炎症引起睑板腺堵塞进而影响泪液分泌，使眼睛愈发干涩[3,4]。结膜炎和睑缘炎常为各种细菌、蠕形螨等感染引起的感染性炎症[5]。目前医院西药主流治疗手段为滴加人工泪液和眼药水两种方法。人工泪液短期内可改善干眼[6]，尤其是对眼睛术后引起的干眼疗效好[7]，但其他原因引起的干眼治疗效果并不稳定，且若长期使用易产生依赖性；眼药水中人工化学药物成分亦可能对人体产生副作用。常见的中医治疗方法有中药内服、中药穴位敷贴、针灸及中药熏蒸等。刘莹等[8]利用补肾养肝明目方（由枸杞、黄精、菊花、熟地、白芍、太子参、麦冬、五味子、山药、白蒺藜、丹参、当归、炙甘草等组成）治疗，有效率达96.7%。谢琳等[9]报道采用益气养阴活血法治疗干眼病，有效率达82%。Ocak 等[10]亦发现中成药芪明颗粒总有效率超过90%。

茶具有抗菌明目等功效，与茶叶中的茶多酚及其氧化产物、茶皂素、茶多糖、维生素C、维生素A 等成分密切相关[11]。蒲公英的黄酮类与多糖类等有良好的抗炎、抑菌杀螨以及保护肝脏的作用[12]。菊花具有疏风清热、平肝明目等功效，对金黄色葡萄球菌等有良好的抑制作用，已被用于干眼症治疗[13]。山茶油主要通过影响细胞壁与细胞膜的通透性，甚至破坏细胞膜的完整性以达到抑菌的效果[14]。由互叶白千层提取的白千层精油作为一种天然抑菌剂，含有单萜烯类、醇类及倍半萜烯类挥发性化合物。互叶白千层精油具有抗细菌和真菌的作用，还被添加至护眼贴中，被广泛应用于眼科疾病中螨虫性睑缘炎的治疗[15,16]。但目前干眼中草药配方的开发与应用仍不多，且给药方式主要以内服汤剂为主。中药熏蒸在短期内对干眼症有较显著的疗效，其不仅能够改善局部眼干症状且在根本上给予辅助治疗，无毒副作用[17]。

为拓宽中草药给药方式如雾化熏蒸理疗，本研究筛选便于雾化的茶、蒲公英、菊花、山茶油、互叶白千层等草本，分别探讨了4 种茶类（绿茶、红茶、白茶、乌龙茶）提取物对S.aureus与E.coli等眼致病细菌的抑菌效果，以筛选出最佳抑菌茶类，并进一步以此种茶类为主与其他中草药按不同浓度进行复配，测试复配方对眼科炎症致病菌的抑菌效果，以期得到对眼科炎症致病菌有较佳抑制效果的复合配方，并将此抑菌消炎配方应用至干眼SPA 的雾化熏蒸理疗中，从而为干眼症的缓解治疗提供一种新型的、天然的辅助性措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 草本

供试草本及草本提取液：茶叶（尤溪绿茶、尤溪白茶、尤溪乌龙茶、尤溪红茶）、野菊花、蒲公英、互叶白千层精油（30%乙醇稀释，浓度0.04 g/mL）、山茶油（30%乙醇稀释，浓度0.04 g/mL）；茶叶由福建农林大学园艺学院茶叶加工工程实验室提供，其余4 种购于福州大参林药店。

1.1.2 供试菌种

供试菌种：金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）、青霉菌（Penicilliumsp.）和镰刀菌（Fusariumsp.），保存于植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室。

1.2 方法

1.2.1 草本水提液的制备

将尤溪绿茶、尤溪红茶、尤溪白茶、尤溪乌龙茶、菊花和蒲公英分别用小型超微粉碎机（KN-500A）磨碎，600 目过筛；4 种茶样分别取5 g 于250 mL 灭菌三角瓶，加入无菌水150 mL，按茶水比1 ∶30（g/v）的比例在沸水浴中浸提45 min，制成1 ∶30（g/v）的茶浸提液。同法分别制成1 ∶10（g/v）的菊花与蒲公英浸提液。将以上各浸提液抽真空过滤，移装于灭菌容量瓶，密封，置4℃冰箱备用。

1.2.2 菌种制备

S.aureus和E.coli分别接种于LB 液体培养基，37℃下培养18 h，并调节浓度1×106备用；Penicilliumsp.和Fusariumsp.分别接种于PDA琼脂培养基，28℃下培养3 d，备用。

1.2.3 抑菌效果测定

采用滤纸圆片法（Kirby-Bauer test）。

单一草本对供试细菌的抑菌试验：将6 mm无菌滤纸片分别放入单一草本提取液中浸泡10 min，以无菌水中浸泡10 min 为对照（除山茶油及互叶白千层精油外），因精油用30%酒精做溶剂，因而在山茶油及互叶白千层精油中以30%的酒精浸泡10 min 做对照。E.coli或S.aureus菌悬液（1×106）200 L 分别均匀涂布于LB 平皿上，再将已浸泡10 min 的2 片滤纸片对称置于距平皿圆心2 cm 处，37℃培养24 h，观察并测量抑菌圈。

单一草本对供试真菌的抑菌试验：取6 mmPenicilliumsp.或Fusariumsp.菌饼接种于平皿中央，再夹取浸泡10 min 的2 片滤纸片对称置于离真菌菌饼2 cm 处，28℃培养72 h，观察并测量抑菌圈。

草本复配组合对供试细菌的抑菌试验：将初步筛选出的白茶与4 种草本蒲公英、菊花、互叶白千层精油、山茶油提取液按表1 组合进行抑菌试验。

表1 以白茶为主的5 种草本提取液复配比例Table 1 Compound formulas ratio of 5 kinds of herbal extracts mainly based on white tea

抑菌圈测量与结果处理：用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈直径，抑菌效果采用试验组抑菌圈直径减去对照组抑菌圈直径来计算，每次抑菌试验5 个平皿重复及3 次生物学重复。采用Excel 做方差分析。

1.2.4 茶和优化复配方多酚测定

茶类多酚测定参照国家标准GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中的福林酚试剂法[18]。筛选出的2 种优化配方中各组分用磨样机磨碎，过40 目筛，按照所占比例称取一定质量的各组分于10 mL 离心管，其余步骤参照GB/T 8313—2018 中的福林酚试剂法[18]。

1.2.5 优化配方抑菌稳定性试验

热处理对优化配方抑菌效果的影响：取2种优化配方的样品液体提取物，分别于40℃、60℃、80℃下加热45 min，采用滤纸圆片法测试对S.aureus和E.coli的抑菌效果。

紫外线对优化配方抑菌效果的影响：取2种优化配方液体提取物分别在紫外灯下照射10 min、20 min 和30 min，采用滤纸圆片法测试对S.aureus和E.coli的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 单方剂的抑菌效果

2.1.1 4 种单一茶提取液的抑菌作用

从4 种单一茶提取液的抑菌效果可看出，不同茶类的提取液对不同菌的抑制能力有一定 差异（图1、图3A）。前期制取1 ∶30、1 ∶50、1 ∶70 和1 ∶100（g/v）的茶水浸提液效果初筛抑菌效果发现，1 ∶30（g/v）茶水比最好。因此采用4 种茶类的1 ∶30 茶浸提液进行抑菌效果比较，结果发现尤溪白茶对E.coli的抑制效果显著大于其他3 种茶类（p＜ 0.05），抑菌圈直径为11.9 mm；尤溪白茶对S.aureus的抑制效果亦大于其他茶类，且与红茶差异显著（p＜ 0.05），其抑菌圈直径为11.8 mm。可见，尤溪白茶对常见眼科致病细菌的抑菌效果较好，故选择尤溪白茶提取物进行后续复配方试验。

图1 4 种单一茶提取液的抑菌效果Figure 1 Effects of four kinds of single tea extracts on inhibiting growth of bacteria

2.1.2 4 种单一草本的抑菌作用

从其余4 种草本单一提取液的抑菌效果可看出，不同草本在对供试菌的抑制能力上表现出较大差异（图2、图3A、图3B）。4 种单剂中，互叶白千层精油对E.coli的抑制效果显著优于其余3 种药剂（p＜ 0.05），抑菌圈直径为14.3 mm；对S.aureus，互叶白千层精油的抑菌圈直径为12.7 mm。互叶白千层精油对于眼科致病真菌（Penicilliumsp.和Fusariumsp.）均有一定抑制作用（图3C），而其余3 种提取物对供试的Penicilliumsp.和Fusariumsp.无抑制效果。

图2 4 种单一草本提取液的抑菌效果Figure 2 Effects of four single herbal extracts on inhibiting growth of bacteria

图3 各单一提取液抑菌效果Figure 3 Antibacterial effects of each single extract

2.2 二二复配的抑菌效果

2.2.1 2 ∶1 复配

从二二复配液（2 ∶1）对供试菌抑菌效果可看出，4 种二二复配液（2 ∶1）在对供试菌的抑制能力上差异不显著（p＜ 0.05）（图4A）。相对于其他3 种复配液，WT ∶EOMA-1 对眼科致病细菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用更好，抑菌圈直径分别为12.0 mm 和11.3 mm；WT ∶CO-1 的抑制效果最弱。且各草本经二二复配后对眼科致病细菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用较单一方无明显提高。

图4 二二复配液对供试菌抑菌效果Figure 4 Antibacterial effect of compound solution containing two components on tested bacteria

2.2.2 3 ∶1 复配

从二二复配液（3∶1）对供试菌抑菌效果看出，四种二二复配液（3 ∶1）在对供试菌的抑制能力上表现出一定差异（图4B）。WT ∶EOMA-2对E.coli和S.aureus的抑制作用均大于其他3种复配液，抑菌圈直径分别为11.4 mm 和13.0 mm；且在E.coli的抑制效果上与其余3 种复配液存在显著差异（p＜ 0.05）。与单方相比，4种二二复配液（3 ∶1）和二二复配液（2 ∶1）一样，其对眼科致病细菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用无显著提高。

2.3 三三复配的抑菌作用

2.3.1 2 ∶1 ∶1 复配

从三三复配液（2 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果可看出，6 种三三复配液（2 ∶1 ∶1）在对供试菌的抑制能力上表现出较大差异（p＜ 0.05）（图5A）。 相比于其他5 种复配液，WT∶C∶CO-1对眼科致病细菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用较好，抑菌圈直径分别为11.9 mm和10.8 mm；WT ∶C ∶T-1 对E.coli和S.aureus的抑制作用均显著最弱（p＜ 0.05）。

图5 三三复配液对供试菌抑菌效果Figure 5 Antibacterial effect of the compound solution containing three components on the tested bacteria

2.3.2 3 ∶1 ∶1 复配

从三三复配液（3 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果看出，6 种三三复配液（3 ∶1 ∶1）在对供试菌的抑制能力上表现出较大差异（图5B）。WT ∶T ∶EOMA-2 效果较优，对E.coli和S.aureus的抑菌圈直径分别为15.4 mm 和14.5 mm，相比于其他5 种复配液差异均显著（p＜ 0.05）；WT ∶C ∶T-2 对E.coli和S.aureus的整体抑制效果均最弱（p＜ 0.05）。

2.4 四四复配与五五复配的抑菌结果

2.4.1 2 ∶1 ∶1 ∶1 和2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 复配

从四四复配液（2 ∶1 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果可看出，4 种草本提取液四四复配（2 ∶1 ∶1 ∶1）在对供试菌的抑制能力上表现出较大差异（图6A）。对于S.aureus，WT ∶C ∶T ∶EOMA-1抑菌效果显著强于其他3 种复配液（p＜ 0.05），抑菌圈直径为12.2 mm；WT ∶C ∶EOMA ∶CO-1的整体抑菌效果显著最弱（p＜ 0.05）。

从五五复配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果（图6A）可看出，WT ∶C ∶T ∶EOMA ∶CO-1 对眼科致病细菌（S.aureus和E.coli）的整体抑制作用与单方剂一致，其抑菌圈直径分别为12.0 mm 和11.5 mm。

2.4.2 3 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 复配

从四四复配液（3 ∶1 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果看出，4 种草本四四复配液（3 ∶1 ∶1 ∶1）在对供试菌的抑制能力上表现出一定差异（图6B）。相比于其他3 种复配液，WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 对E.coli和S.aureus的抑制效果均显著最强（p＜ 0.05），抑菌圈直径分别为14.0 mm和11.8 mm。

从五五复配液（3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）对供试菌抑菌效果（图6B）可看出，WT ∶C ∶T ∶EOMA ∶CO-2 对眼科致病细菌（E.coli和S.aureus）的整体抑制作用与单方剂一致，其抑菌圈直径分别为11.0 mm 和12.0 mm。

2.5 复配液对真菌的抑制效果

各复配液对眼致病真菌（Penicilliumsp.和Fusariumsp.）抑制试验发现，复配液对青霉菌Penicilliumsp.无抑制效果；复配液WT ∶T ∶EOMA-2、WT ∶T ∶EOMA-1、WT ∶C ∶T ∶EOMA-2、WT ∶EOMA ∶CO-1 对镰刀菌Fusariumsp.有一定抑制作用（图7），其余复配液无抑制效果。

图7 复配液对镰刀菌Fusarium sp.的抑菌圈效果图Figure 7 Anti-fugni effect of the compound solution on Fusarium sp.

2.6 提取物有效抑菌物质

2.6.1 4 种茶提取物的有效物质含量

茶叶中的茶多酚具有抗氧化、抑菌抗炎等作用，且在水浸提液中含量较高[12]。由于加工工艺的不同，多酚类物质在加工过程中转化，使得不同茶类多酚含量存在较大差异，故对4种茶类茶样的水浸出物、多酚类、茶色素含量进行测定。从表2 可看出，尤溪绿茶和尤溪白茶的水浸出物和茶多酚含量均显著高于尤溪乌龙茶和尤溪红茶，而尤溪红茶的茶红素、茶褐素含量显著高于尤溪乌龙茶（p＜ 0.05）。

表2 4 种茶样中生化成分含量Table 2 Content of biochemical components in four types of tea samples %

2.6.2 优化配方的多酚含量

对筛选出的2 种抑菌效果较好配方WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2（白茶含量分别为0.120 0 g 和0.066 6 g）的多酚含量测定结果（图8）可看出，单剂白茶的多酚含量高于其余2 种复配方，经方差分析达显著水平（p＜ 0.05）；其中，WT ∶T ∶EOMA-2 多酚含量高于WT ∶C ∶T ∶EOMA-2。

2.7 优化配方的抑菌稳定性

2.7.1 热处理对优化配方抑菌稳定性的影响

将WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2两种优化配方分别在40℃、60℃和80℃下处理45 min，以未处理的优化配方为对照。结果表明，各优化配方在经过不同温度处理后对S.aureus和E.coli几乎无抑制效果；与对照组相比，抑菌效果下降明显。

2.7.2 紫外线照射对优化配方抑菌稳定性的影响

将WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2两种优化配方分别置于紫外灯下分别照射10 min、20 min 和30 min，以未处理的优化配方为对照。结果（图9）显示，紫外照射30 min 优化配方WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 对E.coli抑菌效果显著下降（p＜ 0.05），WT∶T∶EOMA-2则不显著。紫外照射对WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 抑制S.aureus的效果影响不显著（p＜0.05）。

3 讨论与结论

中医认为茶叶具有消毒杀菌的作用，因此本试验探讨茶叶提取物对眼致病细菌（S.aureus和E.coli）及眼致病真菌（青霉菌和镰刀菌）的抑制活性，分别测定了尤溪白茶、尤溪绿茶、尤溪红茶和尤溪乌龙茶的抑菌圈直径，并最终筛选出尤溪白茶作为复配液主要成分。在这4类（种）茶叶浸出液中，抗S.aureus和E.coli作用最强的为尤溪白茶和尤溪绿茶，然后为尤溪乌龙茶和尤溪红茶。由于这4 种茶叶中尤溪白茶和尤溪绿茶的茶多酚含量较高，因此我们推测这些茶叶浸出物抑菌作用的主要成分可能为茶多酚，这与茶多酚在抗菌中有明显作用相一致[19]。进一步地测定4种茶中茶多酚的结果表明，尤溪绿茶和尤溪白茶的多酚含量显著高于尤溪乌龙茶和尤溪红茶（p＜ 0.05）。白茶作为一种天然草本，具有抗视疲劳和抑菌抗炎的功效，且茶叶本身无论是内服还是外用（如干眼SPA中的雾化、熏蒸等）对人体的亲和性表现较高，几乎无副作用，故试验各复配液均采用以白茶为主要成分（浓度最高）的方式进行复配。

本试验初步筛选出抑菌能力较好且对眼睛与眼部皮肤亲和性较高的5 种草本：尤溪白茶、菊花、蒲公英、互叶白千层精油和山茶油。尤溪白茶、菊花、蒲公英进行煎煮浸提，单剂提取液浓度分别为0.033 g·mL-1、0.1 g·mL-1和0.1 g·mL-1；尽管互叶白千层精油已被广泛应用于眼贴或加热眼罩，鉴于纯高浓度互叶白千层精油在干眼SPA 雾化时对眼睛及眼部皮肤具有一定刺激性，本试验选择的是浓度为4%的互叶白千层精油稀释液，山茶油亦同理，以保证对眼睛的亲和性。再以尤溪白茶为主与其余4 种提取液按比例混合，得到4 种两两复配液（2 ∶1 和3 ∶1）、8 种三三复配液（2 ∶1 ∶1和3 ∶1 ∶1）、4 种四四复配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1）和2 种五五复配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）。试验加入了无菌水和30%乙醇为对照。结果方差分析表明，WT ∶T ∶EOMA-2和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 对眼科致病细菌（E.coli、S.aureus）的综合抑制效果最好。其中WT ∶T ∶EOMA-2 表现最佳，对E.coli和S.aureus的抑菌圈直径分别为15.4 mm 和14.5 mm，优于所有单剂的抑菌效果；WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 的抑菌效果仅略低于单剂中的互叶白千层精油，考虑到干眼SPA 雾化熏蒸治疗中高纯互叶白千层精油会对眼睛与眼部皮肤产生一定的刺激性，因此在复配液中建议WT ∶C ∶T ∶EOMA-2，在保证抑菌抗炎疗效的同时提高互叶白千层精油稀释度以增强亲和性。

所有复配液中WT ∶C ∶T-1 和WT ∶C ∶T-2 对S.aureus与E.coli的抑制能力最弱，且相比于各成分单剂其综合抑菌能力显著下降，可能与尤溪白茶在与菊花、蒲公英分别取一定体积复配后各自的质量浓度下降有关，因而引起复配液抑菌能力有所下降。另外，二二复配液、三三复配液与单一浸提液的抑菌效果比较显示出尤溪白茶与菊花、蒲公英之间并无协同抑菌作用。WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 综 合抑菌效果最优，尽管各配方中多酚含量显著低于单剂白茶的茶多酚含量（p＜ 0.05），但与单剂对比抑菌效果有所增强或相当，可见复配液中的互叶白千层精油和山茶油与其他成分之间存在协同效应，且互叶白千层精油的增益效果更显著。互叶白千层精油与山茶油的有效抑菌成分尚待进一步测定。大多数复配液在互叶白千层精油的存在下均表现出良好的抑菌活性。综上结果表明，复配液中的各种抑菌成分之间可能存在协同效应或者拮抗作用，并非所有效果较好的单一植物提取液在按比例混合后其抑菌活性能够得到增强，在实际应用中仍需根据致病源的特性、各复配方的稳定性以及不同浓度下各草本提取液与人体的亲和程度研制复合配方，并进行多次平行试验，以确定其抑菌能力。

本试验还探讨了2 种优化配方WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 在 不 同 温 度和紫外照射时间下的抑菌稳定性，结果表明各优化配方在40℃后抑菌效果显著下降（p＜0.05），这可能与茶树精油的易挥发性和耐热性差[20]以及茶多酚对温度非常敏感[21]等因素有关。因此，优化配方应当在低温下保存。随着紫外照射时间的变化，WT ∶T ∶EOMA-2和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 抑菌效果变化不显著（p＜ 0.05），对紫外线照射的稳定性良好。

本试验旨在为干眼SPA 雾化治疗提供一种天然的草本复合配方，发挥其抑菌抗炎功效。有研究报道许多干眼病患者亦伴有螨虫性睑缘炎，致病原为皮脂螨和蠕形螨[4]，因此后期我们将对试验中的复配液进行抑螨率的测定。