纳米材料的适配子传感器及其在医学检测中的应用*

黎子华，王 婷，张焜和

（南昌大学第一附属医院消化内科江西省消化疾病研究所，江西 南昌 330006）

0 引 言

适配子（aptamer）是短链寡核苷酸（单链DNA 或RNA序列），能够高特异性和高亲和力结合其生物靶分子，在分子识别及其相关的生物医学研究中具有重要的潜在应用价值［1］。纳米材料是微粒尺寸为纳米（nm）级的超细材料，通常介于1～100 nm之间，因其具有表面效应、体积效应和量子尺寸效应，是21世纪最有前途的研究领域之一［2］。近年来，将适配子与纳米材料耦合形成复合体，应用于医学检测研究，显示出良好的应用前景。本文就这一领域的研究进展进行综述。

1 适配子与纳米材料

1.1 适配子

1990年，Tuerk C 和Gold L 利用随机RNA 序列库，结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术，经过多轮筛选，获得了噬菌体T4 DNA聚合酶的2 个高亲和力RNA适配子［3］。这种体外筛选过程被称为指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术。此后，SELEX技术广泛应用于各种生物靶标的适配子筛选及研究应用。

用于适配子筛选的单链随机寡核苷酸文库由人工合成。随机寡核苷酸序列两端为固定序列，是PCR扩增时的引物结合部位，中间为长度20～40 nt的随机序列。文库的序列总数可达1015～1016之多［4］。典型SELEX 实验包括4个步骤：1）将靶分子与文库孵育，使靶分子与寡核苷酸序列特异性结合；2）分离结合核酸序列，去掉未与靶分子结合的序列；3）洗脱与靶分子结合的核酸序列；4）扩增结合核酸序列，制备成新一轮筛选的文库。重复上述过程数轮，文库中能与靶分子高特异性和高亲和力结合的核酸序列得到富集和扩增，再通过克隆和测序分离出适配子。通过SELEX技术已经成功筛出多种靶标的适配子，包括小分子、金属离子、蛋白质、肽、细菌、病毒和活细胞，特别是以活细胞为靶标筛选的适配子，可以结合到细胞表面分子和膜蛋白［5］，实现基于适配子的细胞靶向作用［6］，在癌症检测和治疗中具有重要价值［7］。

适配子和抗体相似，可以高亲和力特异性结合靶分子，但有抗体不具备的一些优势，如靶分子广泛、热稳定性好、易于修饰、分子量小、无免疫原性。适配子通常折叠成独特的三维结构，如茎、内环、凸起、发夹、假结、G-四重结构等。适配子与其靶分子结合的基础是构象互补性、芳香环与适配子核碱基的堆积相互作用、带电基团之间的静电相互作用、范德华相互作用和氢键。

1.2 纳米材料

纳米技术已经被广泛应用于不同领域，包括体内药物传输和纳米尺度的医疗保健。纳米技术推动了纳米医学的产生和发展，升级或改变了在人体细胞水平上的疾病防治［8］。纳米材料可有不同的结构，包括纳米粒子（nano particles，NPs）、纳米管、纳米纤维、纳米棒和薄膜。这些纳米材料在生物传感器的应用已有不少探索研究，并不断被创新［9］。

2 基于纳米材料的适配子传感器

2.1 适配子与生物传感器

生物传感器是适配子用于靶分子检测的一种重要方式。生物传感器一般由3部分组成：生物感受器、换能器和信号读出系统。生物感受器为生物分子，如酶、抗体和寡核苷酸，可以特异性识别感兴趣的分析物，具有高亲和力和特异性［10］。生物分子-分析物结合后产生能量变化，通过换能器转换为可测量的信号，如光学变化、电化学变化或电流变化。与抗体、酶等天然生物感受器相比，适配子具有独特优点，包括核酸的固有特性、结构的高度灵活性和结构设计的方便性。

在生物检测领域，基于色谱和质谱的方法可以实现准确定量检测，但需要复杂、昂贵的仪器设备和训练有素的技术人员。而生物传感器已经成为简单和便携式检测的重要选择，包括现场药物检测、血糖测试和生物标志物筛检等。生物传感器的广泛应用，也与它们的高敏感性和特异性、易于使用、成本效益好和周转时间快有关。

2.2 基于NPs的适配子传感器

2.2.1 AuNPs适配子传感器

AuNPs因其物理和化学特性而被认为是构建生物传感器最受欢迎的纳米材料。近年来，不少文献报道了基于AuNPs的适配子传感器的构建及其检测应用，其中，AuNPs根据其作用不同而扮演不同角色。Shui B 等人［11］制作了一种新型适配子传感器，可以高灵敏度检测在阿尔兹海默症发病中起重要作用的tau 蛋白，他们采用tau-381 蛋白抗体和特异性适配子作为识别元件，半胱胺稳定的AuNPs 进行信号扩增，建立了检测tau-381 蛋白的适配子-抗体夹心检测方法，其tau-381 蛋白检出限为0.42 pmol／L，并通过检测阿尔兹海默症患者血清中的tau-381，验证了该方法的可行性和可靠性。

AuNPs适配子传感器具有良好的检测敏感性，具有很低的检测极限（limit of detection，LOD）。新冠肺炎病毒的刺突蛋白与其致病机制密切有关。Pramanik A 等人［12］将刺突蛋白特异性适配子附着于金纳米星，可通过基于距离的纳米粒表面能量转移（nanoparticle surface energy transfer，NSET）过程，10 min内快速检测刺突重组抗原或病毒本身，从而实现新冠病毒的快速检测，检测限为抗原130 fg／mL，病毒8 颗粒／mL。粘蛋白1（mucoprotein，MUC1）过表达是乳腺和上皮性癌的一个重要特征，Pan M 等人［13］通过NPs自组装制备了金纳米膜-阳极氧化铝（Au-anodic aluminum oxide，AAO）离子通道而获得最佳的Au-AAO 离子通道层，并在层间联结适配子，可观察到一个高度可控的离子整流现象，并由此建立了MUC1浓度与整流比（rectifier ratio，RR）的关系，他们发现，在MUC1浓度为1～104fg／mL的范围内，诱导修饰的Au-AO离子通道具有良好的线性范围，LOD低至0.036 4 fg／mL（0.002 5 amol／L），实现了MUC1 的高灵敏度检测。

2.2.2 AgNPs适配子传感器

除AuNPs外，AgNPs也在纳米材料研究中占据重要地位。近年来不少文献报道用AgNPs结合适配子制作传感器用于生物检测。miRNA-155异常表达存在于乳腺癌或肺癌患者的体液中，Miao X 等人［14］将DNA 稳定的银纳米簇团（DNA-stabilized Ag nano-clusters，DNA／AgNCs）作为荧光探针，与miRNA-155结合后带上负电荷，然后带正电的AuNPs［（+）AuNPs］通过静电吸附到AgNCs 而猝灭荧光，从而构建了一种检测高度灵敏的miRNA-155 检测新方法，得到miRNA-155的检出限为33.4 fmol／L。Afzalinia A等人［15］以AgNPs作为能量受体构建了基于寡核苷酸“三明治型”杂交和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的一种新型、快速、高灵敏度、高选择性荧光生物传感器。在最佳条件下，这种荧光生物传感器可以检测和确定低至0.04 ×10-9（ng／mL）或5.5 fmol／L的miRNA-155。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是一种在活细胞中储存和释放能量的高能量磷酸盐化合物，在许多生理过程中具有不可替代的作用。Xu Y 等人［16］设计了一种基于ATP 适配子的DNA-AgNC＠二硫化钼（MoS2）的复合纳米探针，通过荧光光谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）实现HeLa细胞内ATP的原位荧光成像和定量分析，其结果与ATP 检测试剂盒的检测结果（（24.6 ±1.7）nmol／L vs.（20.4 ±0.8）nmol／L）相似。该方法可通过荧光成像和ICP-MS检测细胞内ATP来评估代谢水平，可以弥补以往成像检测方法无法提供定量结果和ICP-MS生物分析无法提供实时、直观的图像信息的缺陷。

2.2.3 AuNPs和AgNPs适配子传感器

AuNPs和AgNPs 也常一起用于制备传感器，尤其在基于表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技术的生物传感器。Li N 等人［17］制备了一种适配子传感器，在AuNPs 上镀上一层AgNPs 用于增强SERS 信号，可灵敏地检测血清中的MUC1，检测极限达到0.1 U／mL。核蛋白（nuclein，NCL）是一种在多数肿瘤细胞中过表达的多功能蛋白，由于高水平的亚细胞基质效应，现有方法识别核蛋白的特异性有限。Hanif S 等人［18］研制了一种新的技术，利用适配子功能化的金包覆NPs捕捉NCL，以适配子互补DNA链修饰AgNPs作为拉曼报告分子产生SERS信号，前者捕获NCL 后，后者的SERS 信号消失，在MCF7A、HeLa、MCF-10A等多种细胞中成功实现了NCL的亚细胞定位和空间分布分析。

2.2.4 碳NPs适配子传感器

碳纳米材料是重要的无机纳米材料之一。在传感器制作中，使用的碳纳米材料主要有碳点（carbon dots，CDs）、碳纳米管和石墨电极等。近年来，CDs 作为一种新型荧光纳米材料，因其优异的光稳定性、易修饰性、稳定的化学性质、良好的生物相容性和优异的水溶性等特性而受到广泛关注［19，20］。结肠癌激酶-7（PTK-7），是一种膜受体，可调节Wnt信号通路［21］，在肺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤中均有过表达，检测外周血中PTK-7 是早期诊断的新途径［22］。由于外周血中PTK-7浓度较低，需要高灵敏度和高选择性生物传感器才能检测。然而，尽管荧光材料具有优异的光学性能，但由于缺乏良好的选择性，PTK-7 传感器在开发的过程中受到一些限制。Ma Y等人［23］研制了一种基于多CDs和适配子的信号放大荧光探针，他们选择PTK-7适配子修饰的y-CDs和b-CDs的荧光分别作为检测信号和内标记，用不含PTK-7 的Fe3O4和适配子互补序列化合物淬灭y-CDs的荧光，加入PTK-7 后荧光恢复，然后用DNase I消化游离适配子，再扩增检测信号，从而更加灵敏地检测PTK-7，其LOD低至0.016 ng／mL。

碳纳米管是一种由碳原子Sp 杂化形成的石墨烯片层构成的无缝、中空管体，根据层数不同，可分为单壁碳纳米管、双壁碳纳米管和多壁碳纳米管。碳纳米管因具有独特的机械性、良好的电导率和热导率、表面可修饰性强等优点，使其成为热门的非金属无机纳米材料。基于这些优点，Beqa L等人［24］利用金纳米爆米花附着与适配子结合的单壁碳纳米管设计新型杂化纳米材料，用于定向诊断和选择性光热治疗乳腺癌，对SK-BR-3 乳腺癌细胞的检测能力高达10个／mL，并且在785 nm和1.5 W／cm2功率的激光照射下能有效地杀灭癌细胞。Kivrak E等人［25］则利用纳米纤维修饰一次性铅笔石墨电极（pencil graphite electrodes，PGEs），提出了一种基于敏感电化学适配子的生物传感策略用于人类非小细胞肺癌的检测，检测限为1.2 ×103cells／mL。

2.2.5 基于NPs的电化学适配子传感器

电化学传感器因其易于制作、成本效益高和容易使用，也常用于生物传感器检测肿瘤标志物的研究［26，27］。电化学生物传感器通过被分析物结合到电极表面发生电容性变化或发生氧化和还原反应产生电流或电位响应而达到检测目的。灵敏、准确检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）对心肌梗死的诊断至关重要。Sun D 等人［28］基于DNA 纳米四面体（nano tetrahedron，NTH）捕获探针和多功能杂交纳米探针，设计了一种用于cTnI检测的双适配子电化学生物传感器，他们把cTnI适配子Tro 4探针固定在金电极表面用于捕获cTnI，再以磁性Fe3O4纳米颗粒负载cTnI适配子Tro 6 及信号放大系统，获得了良好的分析性能，该传感器的cTnI 的检测范围达0.01～100 ng／mL，检出下限低至7.5 pg／mL。

2.2.6 基于纳米材料的荧光适配子传感器

1996年，Davis K A等人首次报道到了基于荧光标记适配子的生物传感器［29］。与其他生物传感器相比，荧光传感器具有灵敏度高、操作简便、响应快、不破坏样品或对细胞损伤小、能提供实时信息等优点，因而受到广泛关注。在荧光适配子传感器中，荧光标记的适配子作为识别元件，将荧光信号与传导和分析装置耦合，荧光信号“开”或“关”均可指示适配子与其靶标的结合，并定量检测靶标浓度。

外泌体是细胞来源的纳米级（30～150 nm）膜囊泡，在细胞间通信中发挥关键作用。由于外泌体广泛存在于体液中，并与疾病发展密切相关，其作为诊断性生物标志物的价值越来越被重视。然而，由于目前难以同时鉴定和测量这些纳米大小的囊泡，外泌体的准确定量仍然具有挑战性。Wu M 等人［30］基于磁性和荧光生物探针（magnetic fluorescent bioprobes，MFBPs）开发了一种新型的荧光适配子传感器，可一步敏感性定量检测唾液外泌体。他们在MFBPs中，将标有大量量子点（quantum dots，QDs）的自组装DNA串联体连结到适配子上，后者被锚定在磁性微球（magnetic microspheres，MMs）表面，在适配子识别和捕获外泌体时，将同时触发作为检测信号载体的DNA串联体释放，从而产生“一个外泌体-多个QDs”扩增效应，可以一步定量检测，且具有时间短、灵敏度高、检测限低等特点。而Zhu N 等人［31］设计了一种FRET磁性适配子传感器，利用适配子磁性富集外泌体，利用点亮的FRET 策略实现检测。他们将荧光QDs和适配子引入磁性NPs，当适配子与AuNPs 表面的互补DNA序列结合时，荧光强度降低，而外泌体与互补DNA序列竞争性结合适配子时，AuNPs 的荧光强度增强，QDs荧光强度可在外泌体浓度大范围内（5 ×102～5 ×109个颗粒／mL）呈浓度依赖性地线性增加。

Pei X等人［32］提出了一种竞争性的适配子传感器策略，通过荧光NPs（fluorescent NPs，FNPs）计数来超灵敏多重检测CEA等多种癌症生物标志物，只要一个靶标与一个适配子分子结合，信号传递的FNPs 就会形成一个“三明治”结构的纳米复合材料，可在荧光显微镜下进行观察和计数，这种策略适用于单路和多路检测，检测下限比传统方法提高了约1 000倍。

3 纳米材料在其他适配子检测中的应用

适配子生物传感也可用于癌细胞的检测［33］。Norouzi A等人［34］制作了一种新型检测癌细胞的功能DNA 纳米组装体，由一个DNA串联体与大量的粘端三向连接体自组装而成。当一个适配子引导纳米组件到目标癌细胞时，嵌入纳米组件中的模拟过氧化物酶产生比色信号，颜色变化可以通过肉眼清晰地辨别出来。

检测循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）在癌症诊断中具有重要作用，但由于CTC 在大量血液细胞中丰度极低，其检测并不容易［35］。检测CTC，首先是富集，然后再进行免疫表型分析。靶抗原是细胞识别所必需的，然而，并不是所有的癌细胞都能表达靶抗原，导致检测困难和可能的假阴性结果。Ho L C等人［36］基于细胞内“开启”的逆转自猝灭荧光方法，将含有罗丹明6G（Rhodamine 6G，R6G）的1，3-苯二胺树脂（1，3-phenylenediamine resin，DAR）NPs 与适配子SGC8C 结合制备成SGC8C-R6GDARNPs，将含有罗丹明101（R101）的1，3-苯二胺树脂NPs与适配子TD05 结合制备成TD05-R101DARNPs，两者分别识别CCRF-CEM和Ramos细胞。由于自猝灭，2个适配子的DARNPs的荧光强度都很弱，但它们在细胞内由于释放荧光团，荧光强度增加，从而实现循环肿瘤细胞的检测。SGC8C-R6GDARNPs和TD05-R101DARNPs可分别检测识别低至每毫升中44个CCRF-CEM和79 个Ramos 细胞。这种通过回火自淬NPs的方法具有稳定、灵敏、特异和低成本等优点。

4 结束语

近年来，纳米技术在适配子检测应用中进展迅速，尤其在生物分析领域中表现出了巨大的优势和潜力。但基于纳米材料的适配子检测技术商业化并不如意，还面临着一些问题。首先，大多数纳米材料与适配子的结合是用作生物传感器，而生物传感器的制作难度、技术水平仍是需要克服的一大难题。其次，对于现实应用，必须以用户在市场上需要检测的分析物为目标，而许多生物传感器的应用仅限于实验阶段。如何将这些传感器投入现实使用，以及如何在真实世界达到实用的效果，需要再进行更加深入的研究。