氟虫腈/β-环糊精衍生物/壳聚糖纳米微球的制备及性能

张红丽, 张仙娜, 赵雅宁, 玄光善

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042)

随着世界人口的快速增长，粮食需求和农药用量均相应增大[1-2]。大部分农药原药由于水溶性和稳定性差，在实际应用中受到较大限制。传统的液体制剂存在有机溶剂用量大、环境污染重、对靶标生物选择性差、易光解等问题[3-4]。因此开发以水为溶剂、对光、热稳定的剂型成为现代农药剂型的研究热点[5]，以提高药剂持效期，并减少对环境的污染[6]。

氟虫腈 (fipronil，图式1，简称FP) 是一种苯基吡唑类杀虫剂，对蚜虫、叶蝉、鳞翅目幼虫等害虫具有较高活性，且持效期长[7-8]。但由于氟虫腈原药在光、热等条件下不稳定，水溶性极低，且对蜜蜂有一定毒性等[9]，其应用受到较大限制。目前氟虫腈最常用的剂型为5%悬浮剂，其存在助剂毒性高、储存稳定性差、易分层和结块等问题[10]。

近年来，纳米载药系统得到广泛应用。Mattos等[11]将印楝皮提取物包裹在二氧化硅纳米颗粒中，提高了印楝皮的稳定性，延长了其释放时间，并能够有效消灭工蚁。Wibowo 等[12]基于SurSi 肽合成了具有生物相容性的二氧化硅纳米胶囊，并通过控制硅壳厚度来调节囊化氟虫腈的释放速率，可消除工蚁和兵蚁群落，该纳米胶囊的药效比传统产品提高了30%。

β-环糊精 (β-CD) 是一种天然的环状寡糖，被广泛应用于纳米载药系统[13]。β-CD 呈锥形，外表面有亲水基团，内部为疏水空腔，因此可以将疏水性药物包载在空腔中形成包合物[14]。包合物可增加药物的水溶性和稳定性，并维持原有药效[15]。将药物封装到纳米系统中可实现药物缓控释放，提高生物利用度[16]。壳聚糖 (CS) 因其生物相容性、低毒、pH 敏感性和可生物降解性等优点被广泛用作包封材料[17]。

本研究为了克服FP 原药和传统剂型的缺陷，将FP 经β-环糊精衍生物包埋后，再与壳聚糖结合制备负载FP 的CS/β-CD 衍生物纳米农药，使FP 纳米微球具备一系列优良性能，包括缓释性能、高水溶性、高稳定性和pH 敏感性，从而提高杀虫活性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氟虫腈 (fipronil)原药 (纯度97%，上海贤鼎生物科技有限公司)；β-环糊精和羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，山东滨州智源生物科技有限公司)；壳聚糖 (分子质量20 kDa，陕西百川康泽生物科技有限公司)；甲醇、一氯乙酸、冰醋酸和盐酸 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

FA1204B 型电子天平 (上海精密科学仪器有限公司)；BlueStar TY10 型紫外可见分光光度计 (北京莱伯泰科仪器有限公司)；ZS 90 型动态激光散射仪 (英国马尔文仪器有限公司)；TGL-16 型低温离心机 (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；FTIR8400 型傅里叶红外光谱仪 (日本岛津仪器有限公司)；AVANCE 500 型核磁共振波谱仪 (德国Bruker 仪器有限公司)；D-MAX 2500/PC 型X 射线衍射仪 (日本理学公司)；IEM-1200EX 型透射电子显微镜 (日本电子株式会社)。

1.2 羧甲基-β-环糊精 (CM-β-CD)和羧甲基-羟丙基-β-环糊精 (CM-HP-β-CD)的制备

称取1.7025 gβ-CD 于烧杯中，在40 ℃下加入一定量质量分数为20%的氢氧化钠溶液，溶解后于60 ℃下碱化30 min，加入一定量1 mol/L 的一氯乙酸溶液，搅拌4 h，用体积分数为20%的盐酸将反应溶液的pH 值调至7～9，加入过量无水乙醇使产生白色沉淀，静置过夜。过滤，收集滤饼并用无水乙醇洗涤3 次，60 ℃真空干燥即得CM-β-CD。以羟丙基-β-环糊精为原料，采用相同方法制备CM-HP-β-CD。

1.3 相溶解度研究

配制浓度为0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 和0.08 mmol/L 的FP 的甲醇溶液，在278 nm 波长处测定溶液的吸光度。以FP 溶液的浓度为横坐标，以各浓度对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

根据Higuchi 和Connors[18]的理论和Mole 等[19]的方法，将过量的FP 原药分别添加到不同浓度(0、3、6、9、12 和15 mmol/L) 的β-CD、CM-β-CD、HP-β-CD 和CM-HP-β-CD 的水溶液中，120 r/min 避光振荡48 h，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，在278 nm 波长处测定吸光度值，计算FP 的浓度。以β-CD 或其衍生物的浓度为横坐标，以FP 的浓度为纵坐标，绘制FP 的相溶解度曲线，并分别按公式 (1) 和 (2) 计算表观稳定常数Ks和复合效率CE。

式中：S0，不含环糊精时FP 在水中的溶解度(mmol/L)；k，曲线斜率。

1.4 包合物 (ICs) 的制备与表征

包合物的制备参考Sun 等[20]方法。基于相溶解度的研究结果，取0.3837 g (0.25 mmol) CM-β-CD，溶于10 mL 体积分数为50%的甲醇水溶液中，再按1 : 1 (物质的量之比) 的比例取0.1093 g(0.25 mmol) FP，溶于3 mL 甲醇中，将FP 溶液全部滴加到环糊精溶液中，在功率40 W、温度40 ℃下避光超声45 min，旋转蒸发，真空干燥后得包合物 (CM-β-CD/FP ICs) 0.4365 g。采用相同方法制备CM-HP-β-CD/FP ICs。使用傅里叶变换红外光谱 (FT-IR)、核磁共振氢谱 (1H NMR) 和粉末X 射线衍射 (PXRD) 对ICs 进行表征。

物理混合物 (PM) 的制备方法是将FP 与环糊精衍生物按物质的量之比1 : 1 进行简单混合。同法对混合物进行表征。

1.5 纳米微球 (NPs) 的制备

采用离子凝胶法[21]，将CS 溶于体积分数为1%的醋酸溶液中，配制质量浓度为2 mg/mL 的CS 溶液，并用2 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 值至4.5。将CM-β-CD/FP ICs 和CM-HP-β-CD/FP ICs 配制质量浓度分别为1 mg/mL 和4 mg/mL 的ICs 水溶液。按ICs 与CS 质量比分别为1 : 1 和1 : 4 的比例，将ICs 溶液滴加到CS 溶液中，搅拌60 min 后在15000 r/min 下4 ℃离心30 min，沉淀用超纯水洗涤2 次，冷冻干燥，即得CS/CMβ-CD/FP NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs。以CMβ-CD 和CM-HP-β-CD 代替CM-β-CD/FP ICs 和CM-HP-β-CD/FP ICs 制备空白微球。

1.6 纳米微球的表征

准备CS/CM-β-CD NPs、CS/CM-HP-β-CD NPs、CS/CM-β-CD/FP NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 4 种样品，用动态激光散射仪测定其粒径、多分散指数 (PDI) 及Zeta 电位；用注射器取适量纳米微球溶液滴加至500 目 (孔径30 μm) 的铜网碳膜上，用2%磷钨酸染色2 min，室温干燥，于透射电子显微镜 (TEM) 下观察其形态。

1.7 纳米微球的包封率及载药量的测定

将载药NPs 水溶液于15000 r/min 下4 ℃离心30 min，收集上清液，于278 nm 波长处测定上清液中药物的量，记为m1(g)。在相同的条件下，用pH 4.5 的水溶液代替CS 溶液，加入对应量的ICs 溶液，搅拌，离心，上清液测定总药物量，记为m2(g)。取适量载药NPs 粉末，记为m0(g)，溶于0.1 mol/L 的HCl 溶液中，超声10 min，于278 nm波长处测定吸光度值，计算NPs 中药物的质量，记为m3(g)。分别按公式 (3) 和 (4) 计算包封率EE和载药量LE。

1.8 性能研究

1.8.1 溶解度测定 取过量的FP、CM-β-CD/FP ICs、CM-β-CD/FP PM、CM-HP-β-CD/FP ICs 和CM-HP-β-CD/FP PM 样品，分别加入5 mL 去离子水，在室温下120 r/min 避光振摇24 h 后，用0.45 μm微孔滤膜过滤并稀释，于278 nm 波长处测定吸光度值，计算FP 的浓度，判断ICs 的增溶性能。

1.8.2 储存稳定性 参考Gu 等[22]的方法，将新制备的CS/CM-β-CD NPs、CS/CM-β-CD/FP NPs、CS/CM-HP-β-CD NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 溶液，分别置于4 ℃、25 ℃、45 ℃避光条件下储存14 d，测定储存前后NPs 溶液的粒径和PDI，并使用软件GraphPad Prism 8.0.2 对储存前后粒径变化进行统计学处理，使用T 检验法进行检验。

1.8.3 光稳定性 称取一定量的FP、CM-β-CD/FP ICs、CM-HP-β-CD/FP ICs、CS/CM-β-CD/FP NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs，FP 采用体积分数为20%的甲醇水溶液配制3 份质量浓度为25 μg/mL的溶液，其余样品用蒸馏水配制，FP 质量浓度与上述浓度相同，将溶液分别置于紫外光、自然光、暗处避光条件放置48 h，每隔6 h 取出2 mL溶液，并用2 mL 新鲜缓冲液补充到原始体积，在278 nm 波长测定吸光度值，计算溶液中FP 的含量，并计算FP 的降解率，并使用软件GraphPad Prism 8.0.2 对各样品在48 h 时的药物降解率使用字母标记法进行统计学分析，凡有一个相同标记的字母即为差异不显著，凡具不同标记的字母即为差异显著，显著水平α= 0.05。

1.8.4 体外释放行为 采用透析法在pH = 6.0 和pH = 7.4 的条件下分别对FP、CM-β-CD/FP ICs、CM-HP-β-CD/FP ICs、CS/CM-β-CD/FP NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 进行药物体外释放研究。向透析袋 (MWCO = 8 kDa) 中加入80 mg 样品和10 mL 缓冲液，将透析袋置于装有500 mL 缓冲液的烧杯中，25 ℃搅拌48 h，每间隔1 h 取出2 mL溶液，并用2 mL 新鲜缓冲液补充到原始体积，而后于278 nm 处测定吸光度值，计算FP 释放量，并使用软件GraphPad Prism 8.0.2 对各样品在48 h时的药物释放率进行统计学分析。

1.8.5 释放动力学研究 参考Kumar 等[23]的方法，采用零级、一级、Higuchi 和Korsmeyer-Peppas 模型对FP 在不同pH 值下从NPs 中释放的动力学进行分析，根据相关系数 (R²) 选择最适合FP 释放动力学的模型。

2 结果与讨论

2.1 相溶解度研究

如图1 所示，FP 溶液的标准曲线回归方程为y= 7.3883x- 0.0054 (R² = 0.9995)。随着β-CD 及其衍生物的浓度增加，FP 在水中的溶解度呈线性增加，该体系可视为AL型，表明主客体间可形成1 : 1 的包合物[24]。通过曲线的斜率，计算β-CD，HP-β-CD，CM-β-CD 和CM-HP-β-CD 的Ks和CE分别为323.76、364.51、402.74、456.79 和2.10、2.37、2.66、2.97。Ks越大表明药物与环糊精络合的越稳定，CE越大表明环糊精对药物的增溶效果越好，所以4 种环糊精与FP 的络合程度和增溶效果依次为CM-HP-β-CD ＞ CM-β-CD ＞ HP-β-CD ＞β-CD，在最大浓度15 mmol/L 时，对FP 的增溶倍数分别为8.05、7.08、6.58 和5.78 倍。

图1 FP 溶液的标准曲线图和FP 与 β-CD 及其衍生物的相溶解度图Fig.1 Standard curve of FP solution and phase solubility diagram of FP with β-CD and its derivatives

图1 氟虫腈结构式Fig.1 Structural formula of fipronil

2.2 包合物的表征

2.2.1 FT-IR 分析 由图2 可知，FP 及两种物理混合 (PM) 的样品在1634.20 cm-1附近有氨基NH 的伸缩振动吸收，但CM-β-CD/FP ICs 和CMHP-β-CD/FP ICs 出现在1613.49 和1618.10 cm-1附近，说明FP 完全被包裹在环糊精的疏水腔中，而两种PM 的谱图只是环糊精与FP 的叠加[25]。两种ICs 的FT-IR 特征吸收峰与对应的β-CD 衍生物相比，均出现了不同程度的位移，推测是FP 药物分子合并到β-CD 衍生物结构中导致了构象变化，由此可推断ICs 的形成[26]。

图2 各样品的红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of each sample

2.2.21H NMR 分析 由于环糊精的H-3 和H-5位于环糊精腔的内壁内，因此可以通过客分子FP 进入其空腔后H-3 和H-5 的化学位移的变化来判断包合物的形成[27]。图3 为各样品的1H NMR谱图及其化学位移变化情况。在形成ICs 后CM-β-CD的H-3 和H-5 分别向高场移动了0.0110 和0.0098，CM-HP-β-CD 分别向高场移动了0.0128 和0.0087 。由于β-CD 衍生物腔体的H-5 靠近窄侧，H-3 靠近宽侧，两种β-CD 衍生物的H-3 的化学位移变化值均大于H-5，由此推断FP 从β-CD 衍生物的宽侧插入其空腔内，可判断ICs 的形成。

图3 样品的 1H NMR 光谱Fig.3 The 1H NMR spectra of each sample

2.2.3 PXRD 分析 各样品的PXRD 谱图如图4所示。

图4 每个样品的PXRD 光谱Fig.4 The PXRD spectra of each sample

由图4 可知，两种PM 的PXRD 谱图为环糊精和FP 特征峰的叠加，并没有形成新的晶体。两种ICs 的PXRD 谱图，与对应的环糊精的谱图相似，且FP 的特征吸收峰部分消失，引起这一变化的原因可能是FP 进入β-CD 衍生物的内部空腔，形成了新的络合物，可解释ICs 的形成[28]。

2.3 纳米微球的表征

2.3.1 粒径和Zeta 电位 (a) CS/CM-β-CD NPs、(b) CS/CM-HP-β-CD NPs、(c) CS/CM-β-CD/FP NPs 和 (d) CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 4 种纳米微球样品溶液的粒径、多分散指数 (PDI)及Zeta 电位如表1 所示。结果表明，载药NPs 较空白NPs 的粒径大，但均小于350 nm，Zeta 电位分布在11.7～16.6 mV 范围内，说明空白和载药NPs 均具有较好的稳定性，PDI 值均较小，说明载药纳米微球粒径较小且分布均匀。

表1 粒度、PDI 和Zeta 电位的测定结果Table 1 Determination results of particle size, PDI and Zeta potential

2.3.2 TEM 分析 图5 和图6 分别为4 种不同样品的透射电镜下的形貌图和粒径分布图。结果表明，4 种NPs 均呈规则球形，分布均匀，平均直径分别约为170、200、210 和230 nm，TEM 测得的粒径明显小于动态光散射技术 (DLS) 测得的水动力粒径，这种现象可能是因为TEM 测量的是纳米微球的物理尺寸，而DLS 提供的是流体力学尺寸和粒径分布，因此TEM 测量的NPs 尺寸小于DLS 测得结果，这与Bensouiki 等[29]的研究结果一致。

图5 纳米颗粒的透射电子显微镜图Fig.5 Transmission electron microscope of NPs

图6 纳米颗粒在透射电子显微镜下的粒径分布图Fig.6 Particle size distribution of nanoparticles under transmission electron microscope

2.4 载药纳米微球的包封率及载药量的测定

经测定，CS/CM-β-CD/FP NPs 的包封率为(90.42 ± 2.61)%，载药量为(2.89 ± 0.28)%；CS/CMHP-β-CD/FP NPs 的包封率为(74.23 ± 2.69)%，载药量为(5.67 ± 0.38)%。CM-HP-β-CD 形成的NPs 的载药量更高，而包封率有所降低，这可能是由于所制备的CM-HP-β-CD/FP ICs 的本身载药量较高且在制备NPs 时ICs 的浓度和比例较大，故使载药量较大，包封率相对较小。

2.5 性能研究

2.5.1 溶解度测定 FP、CM-β-CD/FP ICs、CMβ-CD/FP PM、CM-HP-β-CD/FP ICs 和CM-HP-β-CD/FP PM 样品在水中的溶解度如表2 所示。

表2 溶解度测定结果Table 2 Solubility result

FP 与CM-β-CD 或CM-HP-β-CD 形成ICs 后在水中的溶解度分别提高了102.34 和76.29 倍，CM-β-CD 对FP 的增溶作用更明显的原因可能是主客体分子间形成了更强的非共价相互作用[30]；两种PM 的溶解度与FP 相比也得到了提高，但较ICs幅度小，由此可推断ICs 对FP 有较好的增溶效果。

2.5.2 储存稳定性研究 将(a) CS/CM-β-CD NPs、(b) CS/CM-HP-β-CD NPs、(c) CS/CM-β-CD/FP NPs 和(d) CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 溶液分别在4 ℃、25 ℃和45 ℃储存14 d 后，其上清液的粒径和PDI 变化结果如图7 所示，

图7 不同温度下贮存14 d 时纳米粒子粒径和PDI 变化图Fig.7 Changes in particle size and PDI of nanoparticles stored at different temperatures for 14 days

由图7 可知4 种NPs 在4 ℃和25 ℃储存14 d后，粒径增大程度均小于30 nm，PDI 值均有一定程度的增大，在45 ℃储存14 d 后，粒径平均增大60～110 nm，PDI 值也相应增大，粒径在储存前后有极显著差异(＊＊＊)，这可能是因为在较高温度储存过程中纳米微球之间发生不同程度的聚集，使得纳米微球的粒径和粒径分布均增大。在25 ℃储存14 d 后载药纳米微球比空白纳米微球粒径增大程度和PDI 值大，这可能是因为载药后β-CD 衍生物与CS 的静电作用有所减弱，NPs 变疏松，在水溶液中膨胀导致粒径变大且粒径分布更加分散[31]。同时4 ℃储存前后CS/CM-HP-β-CD NPs 的粒径有统计学差异(＊)，而CS/CM-β-CD NPs 则没有，可能是因为CM-HP-β-CD 本身所带负电荷较CM-β-CD 少，与CS 的结合程度相对较弱，更易引起粒径变化。

2.5.3 光稳定性研究 在紫外光、自然光及暗处避光条件下的FP 降解率结果如图8 所示。

由图8 可知，在紫外光照射48 h 后，FP 原料药降解率为88.8%，而CM-β-CD/FP ICs 的降解率仅为49.4%，CM-HP-β-CD/FP ICs 的降解率为44.6%，FP 与ICs 和NPs 之间存在显著性差异。同样在自然光和暗处避光条件下，两种ICs 和NPs 的药物降解率均显著低于原料药，且在暗处避光条件下，降解率仍小于10%，说明药物进入环糊精的空腔内部后，可有效减少其在光照下的分解[32]。同时在3 种光照条件下载药NPs 表现出比ICs 更高的稳定性，在48 h 后，3 种光照条件下的NPs 药物降解率分别小于30%、20%和10%，说明ICs 与CS 形成NPs 后，可进一步阻碍光线进入壳层内部，从而提高了药物的光照稳定性。

2.5.4 体外释放行为研究 图9 为FP、CM-β-CD/FP ICs、CS/CM-β-CD/FP NPs、CM-HP-β-CD/FP ICs、CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 分别在pH =6.0 和pH = 7.4 的缓冲液中的释放行为。

图9 各样品在不同 pH 值下的释放行为Fig.9 Release behavior of each sample at different pH

由图9 可知，48 h 后FP 原料药在2 种pH 值下的累积释放率均很低且无显著差异，这与FP 本身在水中的低溶解度有关。两种ICs 和NPs 药物释放率均在pH = 7.4 时较高，pH = 6.0 时较低，并且NPs 的pH 敏感性更显著，这可能是由于在碱性条件下，β-CD 衍生物的解离度较大，CS 去质子化程度增大，两者之间的作用力减弱，从而更易释放药物。48 h 后CM-β-CD/FP ICs 分别累计释放70.72% ± 2.10% (pH = 6.0) 和81.87% ± 2.01%(pH = 7.4)，CM-HP-β-CD/FP ICs 分别累计释放86.22% ± 2.10% (pH = 6.0) 和95.54% ± 1.54%(pH = 7.4)，而原料药在2 种pH 值下累积释放量均小于10%。结果表明，ICs 能够使药物的溶解度增大，释放速率加快，显著提高了FP 在体外的释放量。

两种ICs 均在前5 h 出现药物突释现象，5 h 后CM-β-CD/FP ICs 分别累计释放61.92% ± 1.34%(pH = 6.0) 和74.50% ± 2.02% (pH = 7.4)，CM-HPβ-CD/FP ICs 分别累计释放77.77% ± 1.57% (pH =6.0) 和85.43% ± 2.71% (pH = 7.4)，而相应的NPs 突释现象不明显，CS/CM-β-CD/FP NPs 累积释放量分别小于20% (pH = 6.0) 和35% (pH =7.4)，CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 累积释放量分别小于20% (pH = 6.0) 和40% (pH = 7.4)，说明ICs 与CS 结合形成NPs后，表面药物附着量较少，绝大多数可与CS 结合存在于NPs 内部，介质缓慢扩散进入纳米微球内部后基质膨胀而逐步释放药物。

2.5.5 释放动力学研究 图10 为CS/CM-β-CD/FP NPs 和CS/CM-HP-β-CD/FP NPs 分别在pH=6.0 和pH=7.4 条件下48 h 内的累积释放数据经零级模型、一级模型、Higuchi 模型和Korsmeyer-Peppas模型拟合，所得的释放动力学模型拟合曲线图，各模型的拟合方程及R² 汇总如表3 所示[33]。

表3 载药纳米粒释放动力学拟合概述Table 3 Summary of release kinetics fitting of drug-loaded NPs

图10 载药纳米粒释放动力学拟合曲线Fig.10 Release dynamics fitting curve of drug-loaded NPs

根据图10 及表3 的数据可知，两种载药纳米微球在不同pH 值下的释放模式均最符合Korsmeyer-Peppas 模型，相关系数R²均高于其他3 种模型。两种载药纳米微球在不同pH 值下，其释放指数n均小于0.43，说明药物释放均遵循Fickian 扩散机制，具有缓释性能。Korsmeyer-Peppas 方程释放常数 (Kk)越高，药物释放越快[34]。由表可知两种载药纳米微球均表现出在pH = 7.4 的介质中Kk值较高，说明NPs 在偏碱性条件下释放药物的速率比酸性条件下快，表现出pH 敏感性。

3 结论

本研究以氟虫腈为模型药物，以两种阴离子β-环糊精衍生物为交联剂，与壳聚糖通过离子凝胶法制备了氟虫腈/β-环糊精衍生物/壳聚糖纳米微球。β-环糊精包合物能够提高水难溶性药物氟虫腈的溶解度，氟虫腈/β-环糊精衍生物/壳聚糖纳米微球能够提高主药氟虫腈的储存稳定性和光稳定性。由体外释放曲线可知纳米微球中主药氟虫腈的释放具有缓释效果，并具有pH 敏感性，这有助于消灭消化液偏碱性的虫类，对于氟虫腈环境友好型缓释剂型的研究具有一定的参考价值。