吡噻菌胺对映体在番茄中的选择性降解行为

王富芸, 刘 宇,, 梁宏武, 李 莉*,

(1.山西农业大学 植物保护学院，太原 030031；2.内蒙古大学 生态与环境学院，呼和浩特 010020)

吡噻菌胺(penthiopyrad) 由日本三井化学研发，用于防治叶面和土传病害的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHIs)类杀菌剂[1]，同时含有吡唑和酰胺两种高活性官能团，具有杀菌谱广、活性高及内吸性强等特性[2]，可以有效防治由子囊菌、链格孢属、白粉菌属及黑星菌属等引起的病害，如灰霉病、枯萎病、叶斑病、白粉病及果树黑星病等[3-4]。在我国已登记用于防治黄瓜白粉病、番茄灰霉病及葡萄灰霉病等病害[5]。目前，约30%～40%的农药至少存在一个手性中心，但市场上大多以外消旋体的形式生产和销售[6]。吡噻菌胺具有一个手性中心，由R-(-)-吡噻菌胺和S-(+)-吡噻菌胺两个对映体组成，化学名称为(RS)-N-[2-(1,3-二甲基丁基)-3-噻吩基]-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(结构式见图1)，是一种具有代表性的手性SDHIs 杀菌剂[7]。农药残留联席会议(JMPR)报告表明，其在植物中的主要代谢物是PAM，化学名称为1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺[8]。

图1 吡噻菌胺两种对映体及代谢物 (PAM) 的化学结构式Fig.1 Chemical structures of the two enantiomers of penthiopyrad and its metabolite (PAM)

手性农药不同对映体虽具有类似的理化性质，但其在生物活性、毒理及环境行为等方面具有显著差异。有研究表明，吡噻菌胺对映体在中国4 种典型土壤中的降解速率表现为R体 ＞S体，且二者在土壤中不会发生相互转化[9]。闫冬艳[10]以人体肝癌细胞HepG2 作为体外模型研究吡噻菌胺两个对映体的选择性毒性，发现细胞活力随着吡噻菌胺对映体及外消旋体浓度的增加而逐渐降低，抑制作用表现为峰1 ＞ 峰2 ＞ 外消旋体，诱导乳酸盐脱氢酶活性增加量表现出峰1 高于峰2。S-(+)-吡噻菌胺对立枯丝核菌Rhizoctonia solani的活性是R-(-)-吡噻菌胺的988 倍，相同效果下，外消旋体的用量可减少75%[11]。Ren 等[12]研究了吡噻菌胺对早期胚胎斑马鱼对映选择性毒性，结果表明，S体较R体表现出更高的毒性。因此，从对映体层面评估手性农药的安全性更加科学合理。

目前，对吡噻菌胺对映体残留行为和环境归趋的相关研究较少，仅见Yang 等[13]研究了吡噻菌胺对映体在番茄和黄瓜上的残留消解及代谢行为，并进行了膳食风险评估。结果表明，其对映体在番茄中的消解慢于黄瓜，其在露地降解快于大棚，S体快于R体，表现出微弱的立体选择性，且有低浓度的PAM 检出( ＜ 10 μg/kg)。以上研究未开展其在番茄上的残留分布、储藏稳定性及累积试验，本研究探究了吡噻菌胺在番茄不同种植体系内的立体选择性分布、转化、代谢和累积特性，旨在为吡噻菌胺的风险评估提供科学合理的依据，为科学合理地施用农药提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQD超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(UPLCMS/MS)，美国Waters 公司；SC-3612 台式离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；KQ-600 超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；S30UV 纯水系统，上海和泰仪器有限公司；HM294 均质机，福斯华(北京)科贸有限公司； Lux i-Cellulose-5手性色谱柱(150 mm × 2 mm i.d.；3 µm)，美国Phenomenex 公司。

吡噻菌胺(penthiopyrad)标准品，纯度99%，来自中国农业大学；吡噻菌胺代谢物 (PAM)，购自德国奥格斯堡公司；甲醇、乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；氯化钠为分析纯，购自北京化学试剂公司；甲酸为色谱纯，购自上海安谱实验室技术公司。

1.2 田间试验

番茄品种为seminis SV7011TG，移栽于育苗基地。依据《农作物农药残留试验准则》[14]，于2021 年7 月26 日至8 月30 日分别在北京通州区漷县镇侯黄庄村(116.6°E, 39.8°N)开展大棚及露地田间试验。根据JMPR 的推荐剂量，按有效成分360 g/hm2喷雾施药方式施用20%吡噻菌胺悬浮剂3 次，施药间隔为7 d。在两种种植模式下，分别设置1 个对照小区和1 个处理小区，处理3 次重复，小区间设保护行。其中露地架长50 m，架宽1.1 m，株距为35～40 cm，小区面积为55 m2；大棚架长47 m，架宽1.2 m，株距为25～30 cm，小区面积为56.4 m2。试验地近3 年内未施用干扰试验的药剂。于第1 次施药后2 h 采集番茄果实、叶、茎、根及土壤作为分析试验样品。于第1、2 次施药后2 h 和1、3、5、7 d 及第3 次施药后2 h 和1、3、5、7、10、14、21 d 分别采集番茄果实样品进行消解和最终残留试验。样品采用四分法缩分后，分装于密封袋中，每份样品250～500 g，在 -20 ℃下保存待测。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理 准确称取番茄果实、叶、茎、根及土壤样品5.00 ± 0.05 g 于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，超声提取15 min，加入6 g NaCl 后剧烈振荡1 min，于5000 r/min 下离心5 min。取1.6 mL 上清液转移至称有50 mg 石墨化碳吸附剂(PC) + 50 mgN-丙基乙二胺(PSA) + 150 mg MgSO4的净化管中，于2500 r/min 下振荡5 min，10 000 r/min下离心3 min。上清液通过0.22 µm 滤膜过滤到进样瓶中，待UPLC-MS/MS 分析。其中番茄根、茎和土壤在加入10 mL 乙腈前需加100 μL 甲酸，其它步骤与上述一致。

1.3.2 仪器条件 色谱条件：Waters ACQUITY UHPLC 系统；Lux i-Cellulose-5 色谱柱(150 mm ×2.0 mm i.d.； 3 μm)；柱温为20 ℃；流速为0.30 mL/min；进样量为3 μL；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 The gradient elution conditions

质谱条件：电喷雾正离子扫描(ESI+)；多反应检测(MRM)模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂温度500 ℃；脱溶剂气流量1000 L/h；锥孔气流量10 L/h；其他质谱参数见表2。

表2 吡噻菌胺和PAM 的主要质谱参数Table 2 Main mass spectrum parameters of penthiopyrad and PAM

1.4 标准溶液配制及标准曲线绘制

准确称取吡噻菌胺及代谢物PAM 标准品，分别用乙腈配制成998 mg/L 和1000 mg/L 的标准储备液。逐级稀释后配制成质量浓度分别 0.002、0.005、0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50 和1.0 mg/L 系列标准溶液，在上述 UPLC-MS/MS 的条件下进行测定，按上述仪器条件进样，以吡噻菌胺对映体及代谢物 PAM 的各基质标准溶液质量浓度与色谱峰面积绘制标准曲线，y表示峰面积，x表示质量浓度。

1.5 添加回收试验

在番茄体系(果实、叶、根、茎、土壤)每种空白样品中分别添加0.005、0.1 和1 mg/kg 3 个水平的吡噻菌胺R体、S体和代谢物PAM 标准溶液，每个添加水平重复5 次，按照1.3.1 和1.3.2节方法进行样品前处理及分析测定，计算添加回收率及相对标准偏差(RSD)。

1.6 数据处理

1.6.1 降解动力学分析 吡噻菌胺对映体在番茄中的降解半衰期计算见公式(1)和公式(2)。

其中，C0为目标物的初始含量，mg/kg；Ct为在时间t时的含量，mg/kg；k为降解速率常数；t1/2为半衰期，d。

1.6.2 对映体选择性降解评价指标 采用对映体分数EF 值作为评价吡噻菌胺对映体选择性降解的指标，按公式 (3)[15]计算。

其中：CR为R-(-)-吡噻菌胺的含量，mg/kg；CS为S-(+)-吡噻菌胺的含量，mg/kg。

EF 值范围为0 ≤ EF ≤ 1，当EF = 0.5，表明两个对映体降解速率相同。样品中吡噻菌胺对映体EF 值偏离0.5 程度越大，表明对映体选择性降解行为越明显。当0.5 ＜ EF ≤ 1，代表S体优先降解；当0 ≤ EF ＜ 0.5 时，代表R体优先降解[15]。

1.6.3 累积效应的计算 累积效率(deposition efficiency, DE)的计算公式[16]见公式(4)。

其中，C0为目标物的初始浓度(即是根据降解公式计算的初始含量)，mg/kg；Dosage 为吡噻菌胺的有效成分施用剂量，g/hm2；m为每公顷番茄的日产量，kg/hm2。本研究中大棚番茄日产量为495 kg/hm2，露地番茄为375 kg/hm2。

基于初始残留量(RA0)和平均残留量(RAaverage)评估重复喷施农药后的残留累积量，分别按公式(5) 和 (6) 计算。

C0-n为n次施药后的初始残留量，mg/kg；Caverage-n为n次施药后同一对应时间的平均残留量，mg/kg。

2 结果与讨论

2.1 分析方法验证

本研究中番茄体系(果实、叶、根、茎、土壤)的标准曲线及基质效应计算结果如表3 所示。在不同基质中，吡噻菌胺对映体和代谢物PAM 的标准曲线在0.002～1 mg/L 范围内线性良好，R2＞0.99。吡噻菌胺R、S体及其代谢物PAM 在番茄体系中的基质效应分别在 -46.8%～-4.1%、-42.4%～-7.9%和 -34.4%～ -9.5%之间，具有不同程度的基质效应。因此，为减少基质效应带来的定量误差，本试验采用基质标准曲线进行定量[17]。吡噻菌胺R体、S体和代谢物PAM在番茄体系中的添加回收试验结果见图2，其平均回收率分别在77%～98%、81%～101%和81%～97%之间，RSD 分别在1.6%～5.1%、1.6%～4.2%和0.5%～6.5%之间，定量限(LOQ)为0.005 mg/kg。吡噻菌胺代谢物PAM 及对映体典型色谱图如图3 所示，其保留时间分别为2.79 、9.26 和10.38 min。综上表明该方法具有较好的准确性及重现性，可用于分析吡噻菌胺对映体在番茄体系中的对映选择性。

表3 番茄体系 (果实、叶、根、茎、土壤) 的标准曲线及基质效应Table 3 Standard curve and matrix effect in tomato system (tomato fruit, leaf, root, stem, and soil)

图2 番茄体系(果实、叶、根、茎、土壤)中的回收率及相对标准偏差(RSD)Fig.2 Recovery and relative standard deviation (RSD) in tomato system (tomato fruit, leaf, root, stem and soil)

图3 吡噻菌胺对映体及代谢物PAM(0.5mg/kg)在Lux i-Cellulose-5 柱上的色谱图Fig.3 The chromatogram of penthiopyrad enantiomers and PAM at the concentration of 0.5 mg/kg on the column of Lux i-Cellulose-5

2.2 储藏稳定性

储藏稳定性与含水量、储藏温度及时间[18]、农药理化性质及基质特性[19]等因素密切相关。吡噻菌胺对映体及代谢物PAM 在番茄中的储藏稳定性结果如表4 所示，其在番茄上于 -20 ℃条件下储藏100 d，吡噻菌胺R体、S体和PAM 的降解率分别在 -3%～12%、1%～9%和 -4%～1%之间，均小于30%。表明在储藏期间吡噻菌胺R体、S体及代谢物PAM 在番茄中是稳定的，储藏过程不会影响田间试验样品检测结果的准确性。

2.3 吡噻菌胺对映体在番茄中的残留分布

采集第一次施药2 h 后的番茄体系样品，其对映体在大棚和露地两种种植条件下的分布结果如图4A 和4B 所示，吡噻菌胺R体和S体在番茄植株中的浓度表现为：叶 ＞＞ 茎 ＞ 果实。大棚及露地条件下，两种对映体在叶中浓度最高，大棚条件下分别为4.69 mg/kg 和5.26 mg/kg，露地条件下分别为3.64 mg/kg 和4.09 mg/kg，大棚高于露地，S体高于R体。

图4 吡噻菌胺对映体在番茄体系中的分布(A 和B 分别为大棚和露地残留分布)Fig.4 Distribution of penthiopyrad enantiomers in tomato system (A and B represent the residue distribution in greenhouse and open field, respectively)

本研究结果与汪志威[20]研究百菌清及毒死蜱在黄瓜中的残留分布结果一致，均表现为叶部残留量高于其他部位，可能与施药方式有关，叶片直接接触农药，造成叶上的农药残留量较其他部位大。大棚残留量高于露地，可能是由于大棚高温及微生物活动所致，也可能是大棚中作物生长期延长所致，降解减慢，造成大棚残留高于露地[21]。

2.4 吡噻菌胺对映体在番茄中的选择性降解

采集第2 次和第3 次施药后的番茄果实样品，吡噻菌胺对映体在番茄中的降解曲线如图5 所示，降解参数如表5 所示。本试验研究了第3 次施药后其对映体在番茄体系中的降解动态。结果表明，吡噻菌胺R体和S体的降解规律均符合一级动力学方程，r为0.9315～0.9400。露地条件下R体和S体在番茄中的半衰期分别为5.43 d 和5.10 d，大棚条件下二者对应的半衰期分别为8.09 d和7.80 d，吡噻菌胺在番茄体系消解过程中的EF 值如图6 所示，其在露地和大棚条件下EF 值均大于0.5。以上结果表明，在两种种植条件下，S体降解快于R体，且在露地条件下立体选择性更为明显。该结果与Yang 等[13]研究吡噻菌胺对映体在露地及大棚黄瓜、番茄上的降解结果相似，均为S体快于R体。Wang 等[11]研究其在葡萄、西瓜和梨上的消解行为，结果表明其在葡萄上降解表现为S＞R，西瓜为R＞S，其在梨中3～7 d 时表现为R＞S，在10 d 后无对映选择性降解，可能与不同作物种类中酶活性差异有关。

表5 露地和大棚种植条件下吡噻菌胺对映体在番茄中降解的相关参数Table 5 Relevant parameters for dissipation of penthiopyrad enantiomers in tomato under open field and greenhouse planting conditions

图5 吡噻菌胺R 体和S 体在露地和大棚种植条件下在番茄中的降解曲线Fig.5 The dissipation regressive curves of R-(-)-penthiopyrad (A, C) and S-(+)-penthiopyrad (B, D) in tomatoes under open (A, B) and greenhouse (C, D) conditions

图6 露地和大棚种植条件下吡噻菌胺在番茄中的EF 值Fig.6 EF values of penthiopyrad in tomato samples under open filed and greenhouse conditions

研究表明，不同作物表现出相同或不同的对映选择性，可能是由于相应功能的酶参与了对映体选择性降解[22]。酶系统可能对其中一个对映体较敏感，致使敏感对映体优先降解[23]。如R-(-)-甲基异柳磷在豇豆和黄瓜中优先降解，而辣椒中S-(+)-甲基异柳磷优先降解[24]。S-(+)-粉唑醇在黄瓜中优先降解，葡萄中则表现出相反的结果[25-26]。手性农药在作物中的对映选择性降解行为还需进一步研究。

2.5 吡噻菌胺对映体在番茄中的最终残留

吡噻菌胺对映体在露地和大棚番茄中最终残留结果见表6。结果表明，在露地条件下，末次施药后5～7 d 吡噻菌胺R 体和S 体的残留量分别为0.058±0.007 mg/kg、0.048±0.014 mg/kg、0.045±0.004 mg/kg 和0.038±0.009 mg/kg；大棚条件下，末次施药后5～7 d 二者对应的残留量为0.073±0.012 mg/kg、0.037±0.020 mg/kg、0.060±0.013 mg/kg 和0.029±0.015 mg/kg。代谢物PAM 的浓度低于LOQ。中国[27]和欧盟[28]的最大残留限量(MRL)为2 mg/kg，日本[29]为3 mg/kg，以上结果显示吡噻菌胺对映体在露地及大棚种植条件下，其在番茄中的残留量均低于2 mg/kg，符合农药最大残留限量标准。

表6 露地和大棚种植条件下吡噻菌胺在番茄中的残留量Table 6 Residue of penthiopyrad in tomatoes under open field and greenhouse conditions

2.6 吡噻菌胺对映体在番茄中的累积效应

如表7 所示，吡噻菌胺对映体在番茄中的初始残留量随着施药次数的增加而增加，露地高于大棚，R体高于S体。3 次施药后，吡噻菌胺对映体在番茄上的累积效率(DE) 表现为：露地R体(0.05%) ≈ 露地S体(0.05%) ＞ 大棚R体(0.04%) ＞大棚S体(0.03%)。计算3 次施药后的RAaverage，结果表明：露地R体为1 : 1.27 : 1.25，S体为1 :1.23 : 1.24；大棚R体为1 : 1.49 : 1.17，S体为1 :1.46 : 1.14。吡噻菌胺对映体在番茄中的累积顺序为：大棚R体(1 : 1.49 : 1.17) ＞ 大棚S体(1 : 1.46 :1.14) ＞ 露地R体(1 : 1.27 : 1.25) ＞ 露地S体(1 : 1.23 :1.24)，表明在露地及大棚番茄上多次喷施吡噻菌胺会使其在番茄上累积。

表7 重复施药3 次吡噻菌胺对映体在番茄中的初始残留量Table 7 The calculated initial residues of penthiopyrad in tomatoes after three repeated applications

以往研究多集中在多次施药后的消解及最终残留，对多次施药后的残留消解及累积的研究相对较少，仅有Wang 等[16]研究了4 种杀菌剂在温室草莓上的残留消解及累积，发现4 种杀菌剂均表现出较高的累积效率，表现为腐霉利 ＞ 嘧菌环胺 ＞ 嘧霉胺 ＞ 吡唑醚菌酯。Cui 等[30]研究了氟唑菌酰胺在豇豆及黄瓜上的累积，发现多次喷施氟唑菌酰胺造成其在黄瓜(1 : 2.21 : 1.16)及豇豆(1 :1.33 : 1.05)中累积。本研究结果与前人研究结果一致，表明多次施药会造成农药累积。因此建议在实际生产过程中应科学合理地减少施药次数及施药量以减少作物上的农药残留累积。

3 结论

本研究基于优化的QuEChERS 前处理方法，结合Lux i-Cellulose-5 手性色谱柱及UPLC-MS/MS 验证了吡噻菌胺手性对映体在番茄中的残留分析方法。结果表明，该方法准确度和精密度等均符合农药残留试验准则要求。同时，该对映体及代谢物在番茄中-20 ℃条件下储藏100 d 的降解率均低于30%，不会影响残留测定结果的有效性。在大棚和露地两种种植模式下，其对映体在番茄中的消解均符合一级动力学方程，R2＞ 0.99，露地条件下，R体和S体的半衰期分别为5.43 d和5.10 d，大棚条件下二者对应的半衰期为8.09 d 和7.80 d，露地降解快于大棚，且EF 值均大于0.5，表明S体降解快于R体，且多次喷施吡噻菌胺会造成其在番茄上累积。残留分布试验结果显示对映体主要分布在叶中，表现为叶 ＞ 茎 ＞ 果实，于末次施药后5 d，其在番茄中的残留量均低于我国最大残留限量(2 mg/kg)，表明按推荐方法在番茄上施用吡噻菌胺符合我国良好农业规范，满足食品安全的要求。本试验系统地研究了吡噻菌胺对映体在番茄上的消解、累积、残留分布规律及储藏稳定性，揭示不同栽培环境下其在番茄中的降解差异，为其在番茄上的安全施用提供理论依据及科学指导。