新杀菌剂inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的毒性效应

符 康, 苗鸿飞, 刘艳霞, 李宝玲, 金银银,李宗杰, 汪星宇, 柴婷婷, 崔 峰*,

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江省绿色农药 2011 协同创新中心，杭州 311300；2.浙江农林大学 食品与健康学院，杭州 311300)

Inpyrfluxam [图式1，CAS：1352994-67-2，化学名称为3-(二氟甲基)-N-[(R)-2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基]-1-甲基吡唑-4-甲酰胺]是由日本住友化学公司开发的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI) 类杀菌剂，其作用机理是通过抑制病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体II 进而阻断能量代谢，最终导致病原菌死亡[1]。Inpyrfluxam 具有高效、广谱的杀菌活性，适用于大豆、水稻、谷物等多种作物的病害防治[2]。2020 年3 月，inpyrfluxam在日本取得了全球首个登记，后陆续于加拿大、美国、巴西登记上市[3]。

图式 1 Inpyrfluxam 化学结构式Scheme 1 The structural formula of inpyrfluxam

近年来，随着SDHI 类杀菌剂的大量应用，导致其在环境水体中被频繁检出[4]。据报道，大部分SDHI 类杀菌剂对水生生物具有较高毒性[4]。如苯丙烯氟菌唑对鲤鱼和虹鳟鱼的96 h-LC50值分别为3.5 和9.1 μg/L[5]，吡唑萘菌胺对斑马鱼胚胎的96 h-LC50值为230 μg/L[6]。除致死效应外，SDHI类杀菌剂还可影响水生生物的生长发育。Wu 等[7]研究发现，500 μg/L 的联苯吡菌胺和吡唑萘菌胺可造成热带爪蟾胚胎色素减退、眼睛晶状体浑浊、尾轴短缩及鳍窄小，且畸形率可高达100%。1.1 mg/L 氟唑菌酰胺暴露48 h 后，斑马鱼胚胎孵化被显著抑制，出现卵黄囊水肿、心包水肿等畸形，并伴随心率显著下降[8]。钱乐[9]的研究表明，1.0 mg/L 啶酰菌胺处理28 d 可导致斑马鱼成鱼体重和体长被显著抑制。综上，SDHI 类杀菌剂对水生生物的毒性风险应引起广泛关注。Inpyrfluxam作为一种新型SDHI 类杀菌剂，其对非靶标生物尤其是水生生物的毒性效应尚未见报道。本研究拟以斑马鱼胚胎为试验生物，开展暴露试验，以探明新杀菌剂inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的致死毒性和发育毒性效应，旨在为inpyrfluxam 的合理使用和环境安全性评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼饲养与胚胎收集

野生型斑马鱼Danio rerio亲鱼 (AB 品系，4 月龄) 购于南京一树梨花生物科技有限公司，饲养于斑马鱼养殖系统 (北京爱生科技发展有限公司)。饲养用水为ISO 标准水[10]，保持水温 (27 ±1) ℃，光照/黑暗周期为14 h : 10 h，每天喂食3 次新鲜孵化的丰年虾。试验前一天傍晚挑选发育一致的健康斑马鱼亲鱼，按照雌雄比例1 : 1 放入产卵盒中，用隔板将雌雄鱼隔开。次日早晨光照开始后抽开隔板，待雌雄鱼自由追逐交配产卵后，收集受精2 h (2 hours post fertilization, 2hpf)的健康胚胎用于暴露试验。

1.2 仪器与试剂

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪 (美国Waters 公司)；CX23 生物显微镜 (日本Olympus公司)；RXZ 智能人工气候箱 (宁波江南仪器制造厂)；Milli-Q 超纯水系统 (美国 Millipore 公司)。

99.3% inpyrfluxam 标准品 (广州佳途科技股份有限公司)；丙酮 (分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；乙腈 (色谱纯，北京迪马科技有限公司)；甲酸 (色谱纯，阿拉丁试剂有限公司)；99.5%氯化钠 (分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司)。

1.3 致死毒性暴露试验

参照 OECD 236 准则[11]和Lin 等[12]的方法进行。用丙酮将inpyrfluxam 配制成母液，在预实验的基础上，用ISO 标准水稀释inpyrfluxam 母液配制成质量浓度分别为0.050、0.055、0.060、0.065、0.070 和0.075 mg/L 的暴露药液，并设置空白对照组 (ISO 标准水) 和与暴露药液含相同体积丙酮的溶剂对照组 (丙酮体积分数为 0.01%)。试验在200 mL烧杯中进行，每个烧杯装有150 mL的暴露溶液和20 枚2 hpf 的健康胚胎，每个浓度和对照设置3 个重复。将胚胎置于温度为 (2 7 ± 1) ℃，光照/黑暗周期为14 h:10 h 的智能人工气候箱中培养至96 hpf。暴露试验期间每24 h 更换全部暴露药液并在显微镜下观察胚胎死亡情况 (死亡标志为卵凝结、发育停滞和心跳停止[13])，及时清除死亡胚胎并记录死亡个数，根据胚胎死亡率求出LC50值。

1.4 发育毒性暴露试验

根据致死毒性试验结果，设置0.045、0.050、0.055、0.060 和0.065 mg/L 5 个暴露浓度，同时设置空白对照组和溶剂对照组。暴露方法同1.3 节。每24 h 在显微镜下检查胚胎发育情况并清除死亡个体，记录畸形类型、畸形个数、孵化个数，计算孵化率和畸形率。分别于48、72 和96 hpf，从每个重复中随机选取5 个存活胚胎，在显微镜下统计20 s 内心跳次数。96 hpf 时，每重复随机选取5 条存活的孵化仔鱼测量体长。

1.5 暴露药液inpyrfluxam 实际质量浓度测定

在暴露试验开始时和暴露24 h 更换药液前，分别从每个重复中取10 mL 暴露药液至50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，涡旋30 s，再加入5 g氯化钠涡旋30 s，于7000 r/min 离心3 min。取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL 超纯水混匀，经0.22 μm 的有机滤膜过滤后转入1.5 mL 进样瓶中。采用高效液相色谱法 (HPLC) 进行检测。色谱条件如下：C18色谱柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；进样量10 μL；流动相为V(乙腈) :V(0.1%甲酸水溶液) ＝70 : 30；流速0.2 mL/min；紫外检测波长240 nm；检测时间为7 min。

1.6 数据分析

采用SPSS 16.0 进行数据分析，用概率单位法计算LC50值。独立样本T 检验结果显示，空白对照组和溶剂对照组胚胎所有指标均无显著差异，故在本研究中使用溶剂对照组数据进行结果分析和讨论。处理组和对照组之间的差异采样单因素方差分析 (ANOVA) 和Dunnett 分析，P＜ 0.05，表示差异显著；P＜ 0.01，表示差异极显著。使用GraphPad 8.0.2 对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 暴露药液中inpyrfluxam 实际质量浓度测定结果

如表1 所示，所有暴露药液中inpyrfluxam 实际质量浓度在0～24 h 之间与理论质量浓度的偏差均低于20%，因此，本研究中，inpyrfluxam 药液的理论质量浓度可以代表实际质量浓度[10]。

2.2 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的致死毒性

试验结果显示，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎具有较强的致死能力，其对斑马鱼胚胎的72 h-LC50值和96 h-LC50值分别为0.068 mg/L 和0.063 mg/L(表2)。根据《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性分级标准[14]，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的毒性等级为剧毒。

2.3 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的致畸效应

如图1 所示，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎具有明显的致畸效应，可引起斑马鱼胚胎卵黄囊水肿(yolk sac edema, Yse)、心包水肿 (pericardial edema,Pe) 以及脊柱弯曲 (spinal curvature, Sc)。从图2-A可以看出，斑马鱼胚胎的畸形率随inpyrfluxam质量浓度和暴露时间的增加而显著上升。畸形在48 hpf 开始显著出现在0.050 mg/L 处理组中，胚胎畸形率为18.3%；当质量浓度上升至0.065 mg/L时，畸形率增大至93.3%。在96 hpf，0.065 mg/L处理组胚胎的畸形率高达96.7%。卵黄囊水肿和心包水肿是inpyrfluxam 引起的两种主要畸形症状。卵黄囊水肿率统计结果如图2-B 所示，随着暴露浓度的升高，胚胎卵黄囊水肿率逐渐增大。在48 hpf，卵黄囊水肿率由0.050 mg/L 处理组的15.0%上升至0.065 mg/L 处理组的93.3%。而随着暴露时间的延长，卵黄囊水肿率略有下降，96 hpf时0.065 mg/L 处理组胚胎卵黄囊水肿率降至75.0%。由图2-C 可以看出，心包水肿率随暴露浓度和时间的增加而显著上升，从16.7% (0.055 mg/L，48 hpf) 上升至83.3% (0.065 mg/L，96 hpf)。

图1 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的致畸作用Fig.1 Embryonic malformations caused by inpyrfluxam after exposure

图2 Inpyrfluxam 暴露后斑马鱼胚胎的累计畸形率 (A)、卵黄囊水肿率 (B) 和心包水肿率 (C)Fig.2 The cumulative deformity rate (A), Yse rate (B) and Pe rate (C) of zebrafish embryos after inpyrfluxam exposure

2.4 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎孵化的影响

由图3 可以看出，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎孵化具有显著抑制作用。对照组胚胎从72 hpf 开始孵化，96 hpf 时所有胚胎完成孵化。随着暴露浓度的升高，斑马鱼胚胎的孵化率逐渐降低。72 hpf 时，胚胎孵化率由对照组的71.7%显著降低至0.060 mg/L 处理组的5.0%，而0.065 mg/L 处理组的胚胎均未孵化。在96 hpf 时，0.065 mg/L处理组的胚胎孵化率仅26.7%。

图3 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎孵化率的影响Fig.3 Effect of inpyrfluxam on the hatching rate of zebrafish embryos

2.5 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎心跳的影响

Inpyrfluxam 暴露后，斑马鱼胚胎的心跳被显著抑制，并呈现明显的剂量-效应关系 (图4)。在48 hpf，0.050 mg/L inpyrfluxam 处理组斑马鱼胚胎心跳次数显著降低至对照组的88.0%，当inpyrfluxam浓度升高至0.065 mg/L 时，胚胎心跳次数下降至对照组的64.9%。72 hpf 时，0.045 mg/L inpyrfluxam即可显著抑制胚胎心跳。在96 hpf，0.065 mg/L inpyrfluxam 处理组斑马鱼胚胎心跳次数仅为对照组的45.3%。

图4 Inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎心跳的影响Fig.4 Effect of inpyrfluxam on the heartbeat of zebrafish embryos

2.6 Inpyrfluxam 对96 hpf 孵化仔鱼体长的影响

如图5 所示，96 hpf 时，孵化的斑马鱼仔鱼体长随inpyrfluxam 暴露浓度的升高逐渐降低。0.055 mg/L inpyrfluxam 处理组中，仔鱼体长显著减小至对照组的94.3%；当inpyrfluxam 增加至0.065 mg/L 时，仔鱼体长下降至对照组的82.7%。

图5 Inpyrfluxam 对96 hpf 孵化仔鱼体长的影响Fig.5 Effect of inpyrfluxam on the body length of the hatched larvae at 96 hpf

3 结论与讨论

致死毒性试验结果显示，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的96 h-LC50为0.063 mg/L，参照《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性等级标准[14]，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎为剧毒。李红等[4]收集了噻呋酰胺等7 种常用SDHI 类杀菌剂对斑马鱼胚胎的毒性数据，除苯并烯氟菌唑对斑马鱼胚胎96 h-LC50值为0.041 mg/L 外，其余6 种SDHI 类杀菌剂的96 h-LC50值 (0.547～3.690 mg/L) 均远高于inpyrfluxam。由此可见，inpyrfluxam 对鱼类的致死能力可能强于大部分同类杀菌剂，其对水生生物的毒性风险亟需引起足够的重视。

除致死效应外，inpyrfluxam 对斑马胚胎具有较强的致畸作用，畸形率随着inpyrfluxam 浓度和暴露时间的增加而显著上升。在48 hpf 时，inpyrfluxam暴露组胚胎开始出现严重的卵黄囊水肿。类似的情况在噻呋酰胺、啶酰菌胺、吡噻菌胺等其他SDHI 类杀菌剂处理后的斑马鱼胚胎中也有报道[9,15]。在卵生鱼类胚胎中，内源性脂质主要储存于卵黄囊中，脂质代谢若被干扰可导致卵黄囊异常[16]。已有研究表明，SDHI 类杀菌剂可造成斑马鱼胚胎脂质代谢紊乱[15]，因此在本研究中，inpyrfluxam可能影响了胚胎的脂质代谢从而导致卵黄囊水肿，相关机制需要进一步研究证实。心脏是斑马鱼胚胎发育过程中的第一个功能性器官[17]。本研究发现inpyrfluxam 暴露后，斑马鱼胚胎发生严重的心包水肿。心包水肿是心脏毒性的典型特征[18]，因此，心脏可能是inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎的重要靶器官。大量研究表明，其他SDHI 类杀菌剂亦可导致斑马鱼胚胎心包水肿[19-21]。此外，inpyrfluxam处理后斑马鱼胚胎心率显著下降，这可能与卵黄囊病变有关。据报道，斑马鱼胚胎发育所需的营养物质主要来储存于卵黄囊中，卵黄囊发育异常会导致营养供应不足[22]。心脏的正常运转需要消耗大量的能量[23]，若营养供应障碍造成能量供应不足，心脏的正常工作就会受到影响，进而导致心率降低。此外，inpyrfluxam 暴露还可导致斑马鱼胚胎脊柱弯曲。这种发育缺陷会影响斑马鱼捕获食物和逃离天敌的能力，从而影响到斑马鱼的生存[24-25]。

研究发现，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎发育有显著的抑制作用。孵化抑制是inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎发育的主要影响之一。随着暴露浓度的升高，斑马鱼胚胎的孵化率逐渐降低；在96 hpf，0.065 mg/L 处理组的胚胎孵化率仅为26.7%。此外，inpyrfluxam 还可显著抑制孵化后的仔鱼体长。0.055 mg/L 及更高浓度inpyrfluxam 处理组中斑马鱼仔鱼体长均较对照组显著减小，0.065 mg/L处理组中仔鱼体长仅为对照组的82.7%。已有研究表明，其他SDHI 类杀菌剂亦可抑制斑马鱼胚胎孵化率及仔鱼体长[4]。有关inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎发育的抑制机理需进一步探究。

综上，inpyrfluxam 对斑马鱼胚胎具有较强的致死和发育毒性。据报道，inpyrfluxam 难以被光解、水解，其在水中的半衰期超过1 年[26]。因此，inpyrfluxam 对水生生物的潜在风险不容忽视，有必要进一步加强inpyrfluxam 对水生生物毒性及作用机理的研究，为inpyrfluxam 的科学合理使用和环境安全风险评价提供充足的参考依据。