NF-κB、TGF-β1 与风湿性心脏病心房颤动患者心房纤维化的关系

陈刚，贺少功，李伟

（河南省平顶山市中医院，河南 平顶山 467000）

RHD 是由急性风湿热（Acute rheumatic fever,ARF）加重或反复发作导致的心脏瓣膜损伤引起的一种慢性瓣膜病变，ARF 是由遗传易感个体对甲型链球菌引起的感染的自身免疫反应引起的[1-2]。AF 在心血管疾病患者中变得越来越常见， 包括RHD、高血压、冠心病、先天性心脏病、心肌病和心包疾病等[3]。 AF 可能诱发恶性心律失常、附壁血栓的发生，出现主要不良心血管病变，将严重影响人体健康[4]。有研究表明，心房结构重构发生在AF 的发作和发展过程中， 将导致左心房扩张和左心室射血分数（LVEF）下降[5-6]。然而，预防或改善心肌纤维化可能会显著降低AF 患者的左心房扩张并改善心功能[7]。 因此，抑制心房纤维化可能是预防AF发展的关键。 心肌纤维化是心脏病病变的一个重要组成特征， 其特征是细胞外基质的过度表达和原纤维胶原的积累[8]。心肌中有五种胶原（即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型和Ⅲ型最常见[9-10]，主要导致心脏疾病进展中的心肌纤维化[11]。NF-κB 是一种转录因子，控制与免疫和炎症反应、细胞生长和黏附有关的基因转录， 在大多数细胞中普遍表达[12]。TGF-β1 是迄今发现的最有效的促纤维化细胞因子， 也是导致心脏成纤维细胞活化和纤维化的关键介质，属于TGF-β 超家族的一个亚家族，能够调节增殖、生长抑制、细胞迁移和侵袭、肌成纤维细胞转化和细胞外基质重塑[13]。本研究检测并比较了两组患者的NF-κB、TGF-β1 水平的变化， 分析RHD 伴发AF 患者的心房纤维化与NF-κB、TGFβ1 之间的关系，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 通过回顾分析2019 年1 月至2020年12 月于我院行心脏瓣膜置换术的RHD 患者100 例。 排除标准：（1） 冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性肺源性心脏病、感染性心内膜炎等心脏病变患者；（2）甲状腺功能亢进患者；（3）严重肝、肾或肺功能障碍或恶性肿瘤患者；（4）服用可以减轻心室重构的药物的患者， 包括血管紧张素转换酶抑制剂、 血管紧张素受体阻滞剂、β 受体阻滞剂和螺内酯等。 其中AF 者62 例为AF 组，SR 者38 例为SR 组。 收集入组患者的一般临床资料，如年龄、性别、左心房内径（LAD）、LVEF、心功能分级等。其中，SR 组患者最大年龄80 岁， 最小年龄63 岁，平均年龄（68.73±5.28）岁。

1.2 研究方法及观察指标

1.2.1 采集标本 所有患者都进行了心脏瓣膜置换手术，在此期间从每个患者中收集约200 mg 右心房组织。每个样品被分成两部分。一部分迅速放入液氮容器中，然后放入-80 ℃冰冻保存；另一部分用盐水溶液洗涤，随后在室温下浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于病理分析。

1.2.2 HE 染色检测心房肌细胞的形态学变化 右心房组织在室温下固定在4%多聚甲醛溶液中至少24 h，并包埋在石蜡中。 将厚度约4 μm 的切片放在干净的带正电荷的显微镜载玻片上。 干燥后，将载玻片在60 ℃环境中加热。在脱蜡和再水合后，洗涤载玻片，用苏木精染色7 min，用0.3%酸性醇区分，在斯科特的自来水替代物中漂洗，用苏木红染色2 min，然后脱水、清除并固定。 所有上述实验都在室温下进行。 光学显微镜被用来观察载玻片。

1.2.3 Masson 染色测定心房肌间质和血管周围的胶原沉积 在脱蜡和再水合后，载玻片被洗涤并在56 ℃的布恩溶液中重新固定1 h， 以提高染色质量。 然后用韦格特的铁苏木精染色载玻片5 min，在酸性品红溶液中染色8 min，然后在磷钼酸溶液中染色5 min。 载玻片随后用苯胺蓝溶液染色，在1%乙酸中分化，快速脱水，在二甲苯中清除，并使用树脂固定介质固定。 Masson 染色的所有步骤都在室温下进行。 蓝色染色显示胶原蛋白的存在，红色染色显示肌肉和细胞质的存在。 使用光学显微镜拍摄高倍光学显微照片。 使用image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics, Inc. Rockville, MD, USA）测定胶原蛋白体积分数（CVF）。

1.2.4 WB 测定心房肌中NF-κB 磷酸化水平 使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液从-80 ℃冰冻保存的右心房组织中提取总蛋白，BCA 蛋白检测试剂盒用于测定蛋白浓度。 使用10% SDS-PAGE 加载和分离变性蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。在室温下，用5%非脂肪乳封闭60 min 后，将膜与初级抗体在4 ℃孵育过夜。 第二天，将膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔孵育， 作为第二抗体在室温下放置2 h。ChemiDoc 触摸成像系统用于检测蛋白质信号，并使用Bandscan 4.3 进行分析。

1.2.5 RT-qPCR 测定心房肌中TGF-β1 水平 使用TRIzol 试剂从-80 ℃冰冻保存的右心房组织中分离总RNA。 定量聚合酶链反应在Illumina-Eco机器上进行， 根据β 肌动蛋白基因表达对结果进行标准化。 反应条件为50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s。用1 g 总核糖核酸进行逆转录聚合酶链反应实验，然后进行40 个循环的聚合酶链反应扩增。 通过分析Cq值和标准曲线，使用荧光信号的变化来量化表达水平；使用RUO ViiA 7 软件对起始模板进行定量分析。

1.3 统计学方法 将所采集数据输入Excel 2013表建立量表数据库。 将所有资料导入计算机，采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。 计数资料以频数表和百分率表示，采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，采用t检验；用Pearson相关进行相关性分析。以α=0.05 为统计学检验标准，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较情况 AF 组患者的LAD 明显大于SR 组患者，两者之间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 两组患者的一般资料比较

2.2 两组患者的心肌组织比较情况 HE 染色显示，AF 组心肌细胞大于SR 组。 AF 组表现出间质胶原纤维排列紊乱。 此外，AF 组的CVF 值明显高于SR 组，具有统计学意义（P＜0.05）。 见图1。

图1 RHD 伴发AF 患者扩张的心房肌细胞和积聚的胶原

2.3 两组患者的NF-κB、TGF-β1 水平比较情况与SR 组相比较，AF 组患者的NF-κB、TGF-β1 水平均明显升高，两者之间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表2。

表2 两组患者的NF-κB、TGF-β1 比较

2.4 RHD 伴发AF 患者心房纤维化和NF-κB、TGF-β1 相关性情况 RHD 伴发AF 患者右心房CVF 与NF-κB、TGF-β1 水平呈正相关关系， 差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表3。

表3 RHD 伴发AF 患者心房纤维化和NF-κB、TGF-β1 相关性

3 讨论

ARF 是遗传易感个体对GAS 咽部感染的自身免疫反应的结果， 链球菌抗原由抗原呈递细胞如巨噬细胞和树突状细胞识别、加工和呈递，导致B细胞产生抗体，B 细胞与人成分交叉反应， 导致多个宿主部位的损伤[14]。心脏瓣膜的长期损伤是ARF更严重的并发症。

有研究报道RHD 的免疫反应可能与胶原自身免疫有关，宿主内皮产生抗基底膜胶原（Ⅳ型）自身抗体是病理过程的触发步骤。 在链球菌感染中，M 蛋白与Ⅳ型胶原的CB3 区结合，导致形成一种复合物，促进胶原结构的构象变化，从而启动抗胶原反应[15]。 因此，一种普遍存在的蛋白质可以成为自身抗原， 导致胶原沉积和胶原降解之间的不平衡，最终导致RHD 的纤维化。 与非风湿性二尖瓣对照相比， 风湿性心脏病患者的二尖瓣显示出较高的Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积， 这是纤维化的证据[16]。

为探讨AF 对心房结构重构的影响， 采用HE染色和Masson 染色评估心肌纤维化程度。 HE 染色显示，AF 组心肌细胞大于SR 组。 通过测量心肌组织间质中胶原的总量和测定CVF 来评价心肌纤维化。 与SR 组相比，AF 组表现出间质胶原纤维排列紊乱。 此外，AF 组的CVF 值明显高于SR 组，有统计学意义 （P＜0.05）。 这些结果表明，RHD 伴发AF 患者具有扩张的心房肌细胞， 并在心房肌中显示广泛的胶原沉积。 心房纤维化是心房结构重塑发生的主要过程，在AF 的发生发展过程中起着关键作用， 减轻心房纤维化以抑制心房结构重塑对预防AF 的发生和发展至关重要[17]。 此外，心房纤维化是由心脏成纤维细胞和上皮细胞介导的，内皮细胞可以转化为成纤维细胞， 这在心脏肥大和心脏纤维化中发挥重要作用[18]。 因此，抑制心肌间质转化以减轻心肌纤维化可能是预防AF 发展的重要途径。

本研究相关性分析结果显示，RHD 伴发AF患者的NF-κB、TGF-β1 水平与右心房CVF 呈正相关，考虑是因为TGF-β1 能够通过上皮细胞和间充质细胞在培养中促进纤连蛋白和胶原蛋白的产生，并通过相关基因转录激活NF-κB，是心房纤维化的潜在关键驱动因素[19-20]。

综上所述，RHD 伴发AF 患者心肌组织中NF-κB 激活可能促进分泌TGF-β1，引起细胞外基质沉积，导致心房纤维化。