植物乳杆菌 (LP HMX-3)对仿刺参生长、消化、免疫和肠道菌群的影响

王梦美，吕成杰，杨顶珑*，赵建民

(1.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2.中国科学院烟台海岸带研究所，山东 烟台 264003)

仿刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)，具有食用和药用双重价值[1]，是我国北方重要的海水养殖经济物种[2]。近年来，腐皮综合征等疾病暴发严重阻碍了仿刺参养殖业的健康可持续发展。一般而言，抗生素和化学药物是防控病害的重要手段，但过度使用抗菌药物往往导致病原菌的进化、药物残留以及环境污染问题，大大增加了人类的健康风险[3]。作为病害防控的重要手段，益生菌因其具有无毒、无抗药性、无残留等特点，可作为一种环境友好的饲料添加剂，广泛应用于仿刺参的养殖业中。

根据FAO/WHO 组织的定义，益生菌是一种在合适剂量对宿主健康有益的活性微生物。其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种杆状、革兰氏阳性、不形成芽孢的兼性厌氧益生菌，能产生一些活性物质，从而改善水产动物的生长性能[4]。例如，其代谢产生的有机酸、细菌素、过氧化氢等物质可抑制病原菌的生长[5]，并通过竞争性抑制作用阻碍病原体在肠上皮上的黏附[6]。目前，已有关于植物乳杆菌在鱼类和甲壳类水产动物中的益生作用研究。在细鳞鲑 (Brachymystax lenok) 中，植物乳杆菌能显著增加细鳞鲑的特定生长率，有效促进其生长[7]；夏雨等[6]通过琼脂扩散法、荧光染色法与分光光度法筛选，发现3 株植物乳杆菌均对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的致病菌有抑制作用，并通过有效黏附于对虾肠黏液抑制病原菌的生长和定殖。此外，植物乳杆菌还能增强水产动物的非特异性免疫反应，并积极调节肠道微生态平衡。例如，Van Nguyen等[8]将热灭活的植物乳杆菌菌株 L-137 添加于尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 饲料中投喂尼罗罗非鱼，发现鱼体内头肾细胞的吞噬活性和血清中溶菌酶活性显著提高；Zheng 等[9]研究发现，植物乳杆菌无细胞提取物和发酵上清液能积极调节凡纳滨对虾的肠道微生物菌群，具有较好的益生潜力。上述研究显示，植物乳杆菌具有促进生长、提高免疫和调节肠道微生态的作用，在水产养殖中具有较大的应用潜力。然而，植物乳杆菌对仿刺参的益生作用和机制鲜有报道。

本实验室前期从仿刺参肠道中分离获得一株植物乳杆菌，命名为LP HMX-3。通过体外实验证明其具有一定的抑菌活性和耐盐性，可在30 的盐度下生长。在本实验中，通过在饲料中添加不同浓度(105和107CFU/g)的LP HMX-3，研究其对仿刺参生长性能、消化酶活性、免疫能力和肠道菌群的影响，以明确植物乳杆菌在仿刺参体内的益生效果及较优添加量，并为植物乳杆菌在刺参养殖中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用仿刺参幼参购自烟台市牟平区某养殖场，实验开始前，将仿刺参置于(17±2) °C 的海水循环系统中暂养2 周以适应环境。暂养期间保持溶氧在5 mg/L 以上，每日换水后投喂基础饲料(烟台蓬安源海洋食品有限公司)和海泥，饲料日投喂量为仿刺参体重的2%～3%(不含海泥)。

实验所用LP HMX-3 为本实验室保藏菌株，从仿刺参肠道中筛选获得，经16SrDNA测序鉴定其为植物乳杆菌。将保种的LP HMX-3 按2%的比例接种到MRS 培养基中，28 °C 静置培养24 h后逐级扩大培养。4 °C，4 000 r/min 离心10 min分钟，收集菌体。用无菌生理盐水冲悬，调整至OD600=1，采用平板计数法[9]计算浓度，逐级稀释至107和105CFU/mL 后添加到仿刺参饲料中。含菌饵料现配现用。

1.2 实验设计

仿刺参暂养2 周后，挑选健康、体重差异较小的幼参[(4.22±0.05) g]随机分散到9 个玻璃缸(160 L)中，每缸30 头。实验设置1 个对照组C组(0 CFU/g)和2 个处理组LL 组(105CFU/g)、LM 组(107CFU/g)，每组3 个重复。养殖实验共进行8 周，期间每天换水1 次，每次1/3～1/2 水量，并吸除残饵和粪便以及记录仿刺参健康状况，每2 周测定仿刺参生长指标。

1.3 样品采集

养殖实验结束后，停食 24 h。捞取每缸全部的仿刺参，分别记录总数并称重，计算增重率(weight gain rate，WGR)、特定生长率(specific growth rate，SGR)和存活率(survival rate，SR)等。从C、LL 和LM 组的每个平行取10 头仿刺参用于样品采集。使用无菌注射器自仿刺参腹腔抽取体腔液10 mL，并经双层300 目筛绢过滤。其中，2 mL 体腔液于4 °C、800 r/min 下离心10 min 收集体腔细胞，并加入1 mL RNAiso Plus(TaKaRa，日本)，用于测定免疫相关基因表达量，每组4 个平行；剩余体腔液用于免疫酶活性测定，每组6个平行。此外，收集仿刺参肠道组织，用无菌PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗后用滤纸吸干，用于消化酶活测定，每组6 个平行。同时，收集仿刺参肠道，用于肠道菌群的测定，每组5 个平行。样品经液氮速冻后，均保存于-80 °C 待测。

1.4 指标测定

生长性能测定 存活率(SR，%)=Ni/N0×100%；

增重率(WGR，%)=(Wi-W0)/W0×100%；

特定生长率(SGR，%/d)=(LnWi-LnW0)/t×100%。式中，Ni是饲养实验结束时存活的仿刺参数量(头)，N0是饲养实验中仿刺参的初始数量；Wi和W0分别为仿刺参的最终体重和初始体重(g)；t为养殖实验进行的天数(d)。

酶活性测定 使用南京建成生物工程研究所的试剂盒(A060-2-2、A059-1-1、A001-1-2、A007-1-1、C016-1-1、A080-2-2 和A054-2-1)分别测定仿刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及肠道中淀粉酶(AMS)、胰蛋白酶(TRP)和脂肪酶(LPS)的活性；采用碧云天生物技术有限公司的BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0012)测定蛋白浓度。

免疫相关基因表达量的测定 采用TRIzol 法提取仿刺参体腔细胞的总RNA，用0.1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度计(Thermo，美国)检测RNA 完整性和纯度。以RNA 为模板反转录合成cDNA。基于ABI 7 500 基因定量实时检测系统(Thermo Fisher 公司，美国)，采用SYBR green Ⅰ方法测定免疫基因Aj-p105、Aj-C3、Aj-catalase 的相对表达量(表1)。定量PCR 的反应体系为20 μL，其中各0.4 μL 的上下游引物(10 μmol/L)、6 μL 模板、10 μL SYBR MixⅠ和3.2 μL 的DEPC 水。反应程序为50 °C 20 s，95 °C 7 min；95 °C 变 性10 s，60 °C 退 火30 s，40 个循环。采用2-△△CT法检测目的基因的相对表达量。

表1 内参和目的基因定量引物Tab.1 Primers of internal reference and target genes

肠道微生物检测 使用FastDNA SPIN Kit for Feces(MP Biomedical)试剂盒提取仿刺参肠道微生物的总DNA。使用引物515F(5′-GTGCCA GCMGCCGCGGTAA-3 ′)和806R(5 ′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16SrDNA的V4 区。用1%琼脂糖凝胶电泳将扩增获得的 PCR 产物进行检测并切胶回收，精确定量后在Novogene 的Illumina MiSeq 平台上进行测序并分析。具体过程参照唐杨等[10]进行。

1.5 统计分析

实验结果以平均值±标准差(mean ± SD)表示。通过统计软件SPSS 26.0 对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，当不同处理组差异显著(P<0.05)时，采用Duncan 氏法作多重比较分析。本研究获得了宁波大学实验动物中心批准，实验过程中操作人员严格遵守GBT2018 伦理规范，并按照宁波大学实验动物中心制定的规章制度执行。

2 结果

2.1 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参生长性能的影响

饲喂不同浓度的LP HMX-3 对仿刺参生长指标和存活的影响结果显示，养殖实验结束后，所有组的仿刺参存活率没有显著差异(P>0.05)；LL组和LM 组的终体重、增重率以及特定生长率均显著高于C 组(P<0.05)，且LL 组的生长指标高于LM 组，但LL 组和LM 组之间没有显著差异(P>0.05)(表2)。由结果可以看出，饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参的生长具有显著的促进作用，添加浓度对仿刺参生长影响不大。

表2 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参生长性能的影响Tab.2 Effects of LP HMX-3 supplementation on growth performance of A. japonicus

2.2 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参肠道消化酶活性的影响

LM 组肠道的脂肪酶活性显著高于LL 组和C 组(P<0.05)；LL 组的淀粉酶活性最高，且显著高于LM 组和C 组(P<0.05)；各组之间的胰蛋白酶活性没有显著差异(P>0.05)(表3)。结果表明，饲料中添加LP HMX-3 有助于提高仿刺参肠道中的消化酶活性。

表3 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参肠道消化酶活性的影响Tab.3 Effects of LP HMX-3 supplementation on digestive enzyme activity of intestine of A. japonicus

2.3 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参体腔液免疫相关酶活性的影响

饲喂不同浓度的LP HMX-3 可以不同程度的提高仿刺参非特异性免疫酶活性(表4)。LL 组和LM 组体腔液的碱性磷酸酶活性显著高于C 组(P<0.05)，但LL 组和LM 组之间没有显著差异(P>0.05)；LM 组的酸性磷酸酶活性显著高于C 组(P<0.05)，LL 组和LM 组的差异不显著(P>0.05)；各组的超氧化物歧化酶活性没有显著差异(P>0.05)；LL 组的过氧化氢酶活性最高，其次是LM 组，2 组之间差异显著且均显著高于C 组(P<0.05)。

表4 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参体腔液免疫酶活性的影响Tab.4 Effects of LP HMX-3 supplementation on immune enzyme activity of coelomic fluid of A. japonicus

2.4 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参体腔细胞中免疫相关基因表达量的影响

饲料中添加LP HMX-3 可以不同程度的提高仿刺参体腔细胞中免疫相关基因表达量。其中，LL 组和LM 组中体腔细胞Aj-p105 表达量显著高于C 组(P<0.05)，LL 组和LM 组之间没有显著差异(P>0.05)；LL 组中仿刺参体腔细胞Aj-catalase基因表达水平最高，其次是LM 组，2 组之间差异显著且均显著高于C 组(P<0.05)。LL 组和LM组中仿刺参体腔细胞Aj-C3 基因表达水平高于C 组，且LM 组与C 组差异显著(P<0.05)(图1)。

图1 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参体腔细胞免疫相关基因表达量的影响不同处理组间不同上标字母表示差异显著(P<0.05)。Fig.1 Effects of LP HMX-3 supplementation on the expression of immune-related genes in coelomic cells of A. japonicus Different letters between different treatments indicate significant difference (P<0.05).

2.5 肠道菌群分析

α 多样性分析 从仿刺参肠道样本中获得的有效序列为61 308～69 999 条，经过进一步的分析，可将其归为1 649～5 574 个操作分类单元(OTUs)。仿刺参肠道菌群的α 多样性以Observedspecies、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、PD_whole_tree 方法进行评估。结果显示，LL 组和LM 组 的Observed-species、Chao1、ACE 和PD_whole_tree 指数均显著高于C 组(P<0.05)，而且LL 组大于LM 组，但2 组之间没有显著差异(P>0.05)；LL 组 和LM 组 的Shannon、Simpson 指 数高于C 组，但各组之间没有显著差异(P>0.05)。α 多样性结果表明，LL 和LM 组肠道中的微生物丰富度和均匀度都高于C 组，且LL 组略高于LM 组(表5)。

表5 饲料中添加LP HMX-3 对仿刺参肠道菌群α 多样性的影响Tab.5 Effects of LP HMX-3 supplementation on α diversity of intestinal flora of A. japonicus

β 多样性分析 主坐标分析(PCoA)可以用来指示不同样本的群落变化。基于加权的Unifrac 距离的PCoA 和非加权的Unifrac 距离的PCoA 表明，LL 组和LM 组的仿刺参肠道菌群相似，均与C 组不同(图2)。聚类分析也显示了相似的趋势，基于加权的Unifrac 距离矩阵和非加权的Unifrac 距离矩阵的UPGMA 聚类分析可以看出，LL 和LM 聚为一个分支，然后与C 组聚为一支，表明LL 组与LM 组中的细菌群落相似性高于C组(图3)。由Veen 图可知，各组的仿刺参肠道样本中共有的OTU 有726 个，LL 组特有的OUT 数量最多(1 564 个)，其次是LM 组(1 203 个)，最少的为C 组(690 个)。β 多样性分析结果显示，LL组和LM 组的物种组成结构相似且菌群多样性高于C 组。肠道菌群的多样性分析表明饲料中添加LP HMX-3 有助于提高仿刺参肠道菌群的菌落多样性，添加量对其菌群多样性和丰富度影响不大。

图2 仿刺参肠道细菌群落结构的主坐标分析 (a) 基于加权 Unifrac 距离(b)基于未加权Unifrac 距离Fig.2 Principal Co-ordinates Analysis (PCoA) of the bacterial community from A. japonicus intestine (a)based on weighted Unifrac diatance (b) based on unweighted Unifrac diatance

图3 仿刺参肠道细菌群落的UPGMA 聚类树 (a) 基于加权Unifrac 距离 (b) 基于未加权Unifrac 距离树枝长度代表样本间的距离。Fig.3 UPGMA clustering tree of the bacterial community from A. japonicus intestine (a) based on weighted Unifrac diatance (b) based on unweighted Unifrac diatanceThe branch length represents the distance between samples.

肠道细菌群落组成 仿刺参肠道微生物可归于79 个门 类、151 个 纲、327 个 目、498 个科、1 116 个属。门水平上，在所有组中，变形菌门(Proteobacteria) 的丰度最高，其次是厚壁菌门(Firmicutes) 。变形菌门的丰度在C 组最高，其次是LM 组，且C 组与LL 组和LM 组有显著差异(P<0.05)；厚壁菌门的丰度在LL 组最高，且与C组有显著差异(P<0.05)，其次是LM 组；而LL 组和LM 组拟杆菌门 (Bacteroidota)、蓝藻门(Cyanobacteria) 和Campilobacterota 的丰度显著高于C 组(P<0.05)，但在2 个处理组中没有显著差异(P>0.05)。另外，LL 组和LM 组放线菌门(Actinobacteriota) 以及酸杆菌门 (Acidobacteriota)的丰度高于C 组(图4，表6)。属水平上，与对照组相比，LL 组和LM 组中潜在的益生菌相关属的丰度增加，包括乳杆菌属 (Lactobacillus)、双歧杆菌属 (Bifidobacterium)、链球菌属 (Streptococcus)和梭菌属 (Clostridium_sensu_stricto_1)(图5)。

图4 仿刺参肠道中门水平上的物种相对丰度柱形图Fig.4 Column chart of relative species abundance at the phylum level of A. japonicus intestine

图5 仿刺参肠道中属水平上的物种丰度热图Fig.5 Heatmap analysis of the species abundance at the genus level in the gut of A. japonicus

表6 仿刺参肠道中门水平上的优势菌群分布Tab.6 Distribution of dominant microflora at the phylum level of A. japonicus intestine

3 讨论

益生菌作为抗生素的替代品被广泛应用于水产养殖业，其具有改变宿主或相关环境微生物群落的潜力，并可通过提高饲料利用率、生长、免疫状态和存活等方式对宿主产生有益影响[11-13]。

在本研究中，饲料中添加105和107CFU/g 的植物乳杆菌LP HMX-3 有助于提高仿刺参的生长性能，且105CFU/g 的添加量具有更优的效果。这一结果与以往在仿刺参[13]和尼罗罗非鱼(O.niloticus)[14-15]中的研究结果具有一定的差异性。在仿刺参中，Li 等[13]发现2 株海水鱼源乳酸菌可显著提高海参的生长性能，其添加量为109CFU/g，研究结果的差异可能与菌种的来源、菌的添加量等因素有关。一般而言，植物乳杆菌可通过产生氨基酸和维生素等营养物质，作为养殖生物的营养增强剂。另一方面，植物乳杆菌能够刺激机体细胞分泌消化酶类，帮助水产动物加强对营养物质的利用[16-18]。本研究显示，仿刺参饲料中添加LP HMX-3 之后，在一定程度上提高了机体淀粉酶和脂肪酶的活性，提高了仿刺参对饲料的消化吸收利用率。

作为海洋无脊椎动物，仿刺参缺乏获得性免疫，主要依靠先天免疫系统来抵御病原侵袭。以往研究表明，AKP、ACP、SOD 和CAT 在棘皮动物的免疫防御中起重要作用[19-20]，其中，ACP 和AKP 能杀死和消化微生物和外来物质。在本研究中，投喂了含植物乳杆菌LP HMX-3 的仿刺参AKP 和ACP 活性均有不同程度的提高，这与 Li等[13]、Yang 等[19]和宫魁等[21]对海参的研究报道相似。值得注意的是，机体免疫活性的高低与益生菌的添加水平存在关联性。例如，AKP 活性在105CFU/g 添加组最高，而AKP 活性在107CFU/g添加组最高，这说明免疫力的高低与益生菌的种类和添加量密切相关。此外，SOD 和CAT 是2 种抗氧化酶，是机体抗氧化防御系统重要的组成部分[22-23]，其在防止细胞损伤和衰老方面亦起着关键作用[19]。在本研究中，仿刺参饲粮中添加植物乳杆菌LP HMX-3 后，CAT 活性显著升高，SOD水平没有显著变化。这可能是因为H2O2作为SOD 的作用产物，其可能会抑制SOD 水平[24]，而对CAT 活性有刺激作用[25]。以上结果可能预示了LP HMX-3 对仿刺参具有重要的免疫调控作用。在仿刺参中，p105[26]、catalase[27]、补体成分3[28]是重要的细胞免疫因子，在免疫防御系统中发挥着重要作用。例如，张斯等[29]发现Aj-C3 在仿刺参体腔细胞中的表达量最高，可能是补体系统中含量较高、较为核心的成员。在本研究中，添加植物乳杆菌后，仿刺参的Aj-p105、Aj-catalase 和Aj-C3 表达量升高，说明LP HMX-3 在一定程度上增强了仿刺参的免疫力。另外，有人认为植物乳杆菌细胞壁中的肽聚糖可能有助于机体免疫刺激[30]，动物肠道中的有益菌群也能刺激免疫细胞分化，激活免疫系统，从而增强宿主的免疫力，促进机体健康生长[31]。

肠道菌群结构和功能对仿刺参生长具有重要意义，与仿刺参的营养代谢和免疫防御等[32]生理过程密切相关。其中，肠道微生物多样性起着重要作用，多样性降低表明肠道微生物群落稳定性变差，养殖生物患病风险增大，朱文根等[33]研究结果显示，草鱼(Ctenopharyngodon idella)呼肠孤病毒感染组的Shannon 指数、Simpson 指数以及Pielou 均匀度显著低于对照组。黄学敏等[34]同样发现，凡纳滨对虾健康苗池的Shannon 指数和Pielou 均匀度均显著高于发病苗池，表明更高的菌群α 多样性有利于水体环境稳定和虾幼体健康,反之可能易造成幼体发病。在本研究中，105CFU/g 组 和107CFU/g 组 的Observed-species、Chao1、ACE 和PD_whole_tree 等α 多样性指标显著高于对照组，这表明饲粮中添加植物乳杆菌LP HMX-3 显著提高了仿刺参肠道菌群的丰富度和均匀度。在仿刺参缺乏特异性免疫的情况下，较高的α 多样性可能代表着其对病原菌的高抗性和对养殖环境的适应性。同时，β 多样性分析发现，植物乳杆菌LP HMX-3 添加组的微生物群落结构发生了明显变化，这表明添加的益生菌--植物乳杆菌LP HMX-3 是影响肠道菌群的关键因素。添加LP HMX-3 后，105CFU/g 组 和107CFU/g 组的特有OUT 增多，且105CFU/g 组多于107CFU/g 组，该结果表明，将仿刺参暴露于不同浓度的益生菌会改变其内在的微生物种群结构[35]。其中，最占优势的门是变形菌门，其次是厚壁菌门，这与Foysal 等[36]的研究结果相似。众所周知，变形菌门细菌广泛分布于海洋环境中，但其在肠道中大量出现可反映肠道微生物群落结构的失调或不稳定，存在诱发炎症反应风险[37]，而厚壁菌门是肠道中的一个优势门，同时是指示肠道健康的良好指标[38]。在添加LP HMX-3 后，仿刺参肠道微生物群中变形菌门的丰度显著降低，厚壁菌门丰度显著升高，初步表明植物乳杆菌LP HMX-3 可以积极调节肠道菌群结构，维持仿刺参体内的稳态。Yang 等[39]通过分子生态网络分析也发现益生菌可以促进海参肠道菌群稳态。此外，投喂植物乳杆菌LP HMX-3 饲料的仿刺参体内拟杆菌门的丰度显著高于对照组。由于拟杆菌门可以参与营养物质的代谢，产生多种多糖水解酶[40]，说明植物乳杆菌LP HMX-3 可能促进了仿刺参对营养物质的消化利用率，促进了仿刺参的生长性能。另外，投喂植物乳杆菌饲料的仿刺参肠道内放线菌门 以及酸杆菌门的丰度也有所增加。放线菌门在维持和发展肠道内稳态、调节肠道通透性以及免疫系统和代谢中起着关键作用[41]，酸杆菌门的细菌成员能产生抗菌物质，或有利于提高仿刺参的免疫状态和抗病能力[42]。

综上所述，饲粮中添加植物乳杆菌LP HMX-3 可以促进仿刺参的生长，提高体内消化酶活性，并积极调节仿刺参的免疫机能与肠道微生物菌群结构。从仿刺参生长的角度来讲，105CFU/g 的添加浓度具有较优的效果。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）