日本鳗鲡TBK1 基因的克隆与免疫功能分析

徐元凯，彭欣慰，林 鹏，王艺磊，冯建军*

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.宁波海洋研究院，浙江 宁波 315832；3.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021；4.农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

TANK 结合激酶1 (TANK binding kinase 1，TBK1)也称NAK 或T2K，是IκB 激酶 (IKK)家族重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于非经典IκB 激酶。TBK1 结构与经典的IκB 激酶IKKα、IKKβ 相似，含有N 端激酶结构域 (KD)、泛素化结构域 (ULD)、二聚化支架结构域 (SDD)，以及C 端结构域(CTD)，其中CTD 结构域替代了IKKα 与IKKβ C端的NEMO 结合结构域 (NBD)[1]。研究发现TBK1 中KD、ULD 和SDD 等3 个结构域间存在相互作用，KD 对TBK1 的激活至关重要，ULD和SDD 主要与IFN-β 的诱导表达密切相关，而CTD 则可促进TBK1 与TANK 和其他适配子的相互作用[2-3]。

哺乳动物中的研究表明，TBK1 可被Toll 样受体、RIG-1 以及MDA5 等模式识别受体激活，激活的TBK1 通过使IRF3、IRF7 磷酸化入核，诱导I 型干扰素IFN-α、IFN-β 等细胞因子的表达，在抗病毒免疫中发挥关键作用[4-5]。小鼠 (Mus musculus)TBK1 能够增强HEK293 细胞抵御水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus)感染的能力，而TBK1 基因敲除的小鼠易受到鼠γ 疱疹病毒68(murine gammaherpes virus 68)感染，且发现该小鼠细胞在刺激物刺激下表现出明显的IFN-β 产生缺陷[6-8]。此外，TBK1 可以磷酸化IKKβ 和IκBα，进而诱导NF-κB 亚基RelA (p65)的核易位，或是同TANK 和TRAF2 形成三元复合物激活NF-κB，参与对NF-κB 信号通路的调控[9-11]。

迄今为止，TBK1 同源基因已在一些硬骨鱼类中被克隆报道，包括大西洋鳕 (Gadus morhua)[12]、青鱼 (Mylopharyngodon piceus)[13]、草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[14]、大黄鱼 (Larimichthys crocea)[15]、斑马鱼 (Danio rerio)[16]、斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides)[17]及鲤 (Cyprinus carpio)[18]等。当鱼体受到不同病毒刺激后TBK1 基因表达水平显著升高，表明TBK1 在机体抗病毒免疫应答中扮演重要角色[13,19-21]，因此有关鱼类TBK1 抗病毒免疫功能的研究备受关注。有学者发现青鱼TBK1 能强烈诱导IFN1 活性[19]，草鱼TBK1 可以激活并促进IRF7 的核易位诱导I 型IFN 和PKR基因的表达[22]，而斑马鱼TBK1 则可通过磷酸化STING 和IRF3 来激活I 型IFN 的表达[23]。虽然以上研究表明TBK1 对于IRF3/IRF7 介导的I 型干扰素信号通路具有重要的调控作用，但鱼类TBK1对细菌免疫应答密切相关的NF-κB 及MAPK 信号通路是否也具有调控作用还未见报道，涉及水产养殖病原菌刺激鱼体TBK1 基因水平变化的研究仅在大黄鱼中有所报道[15]。因此，研究在体和离体状态下主要病原模式分子和病原菌刺激后的鱼类TBK1 基因的表达变化规律、以及鱼类TBK1过表达对于不同免疫相关信号通路的调控作用将有助于对硬骨鱼类TBK1 的功能深入了解，为鱼类免疫应答机制的阐明提供参考资料。

日本鳗鲡 (Anguilla japonica)，俗称白鳝、青鳝、鳗鱼。其味道鲜美、营养价值高，被誉为“水中人参”，在我国已形成了集养殖、加工、销售为一体，年产值达百亿元的大产业，主要集中在福建、广东、浙江三地[24]。但目前大规模、集约化的养殖模式带来了鳗鱼病害的频发和流行，造成巨额经济损失[25]。与其他经济鱼类相比，有关日本鳗鲡免疫学基础研究十分薄弱，制约了鳗鲡产业的健康发展。本实验首次克隆了日本鳗鲡TBK1 基因 (命名为AjTBK1)全长cDNA，利用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术检测了不同病原体相关分子模式以及鳗鲡主要病原菌嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)刺激后的日本鳗鲡主要免疫组织器官以及体外培养的日本鳗鲡肝脏细胞TBK1 基因表达变化，并通过绿色荧光亚细胞定位和双荧光素酶技术对TBK1 蛋白分子的免疫功能进行了研究分析，以期为日本鳗鲡抗细菌、病毒免疫应答机制的阐明奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：日本鳗鲡，体重为45～50 g，购自福建福清鳗鱼养殖场，在实验室于25 °C，1 000 L 循环水中饲养1 周后备用。

细胞：人体肾脏细胞系 (HEK293 细胞)培养在含10%胎牛血清的高糖培养液中，于37 °C，CO2含量5%的培养箱中进行培养；日本鳗鲡肝脏细胞为实验室所有，于27 °C 培养箱中培养。本研究获得了集美大学科技伦理委员会(编号：JMU202203022)批准，实验过程中操作人员严格遵守集美大学科技伦理委员会伦理规范，并按照集美大学科技伦理委员会制定的规章制度执行。

1.2 实验试剂

DNA 凝胶回收试剂盒购自TaKaRa 公司 (日本)，E.Z.N.A.TM Total RNA KitⅠⅠ、无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega 公司 (美国)，胎牛血清购自PAN-Biotech 公司 (德国)，DMEM 高糖培养液、胰蛋白胨、Opti-MEM 低血清培养基 (1×)购自Gibco 公司 (美国)，qPCR SYBR®Green Master Mix 购自Vazyme 公司 (中国)，Lipofectamine™ 3 000购自Invitrogen 公司 (美国)，Dual-Glo luciferase assay system 购自Promega 公司 (美国)。

1.3 组织采集与在体实验免疫刺激

日本鳗鲡于实验室暂养1 周后进行实验，浸入含有1×102mg/L 丁香酚的水中 (中国上海第二试剂厂)麻醉后，解剖取日本鳗鲡各组织样品，包括肝脏、脾脏、鳃、肾脏、肠、心脏、皮肤和肌肉，用于RNA 提取。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为本实验室所有[26]，将其接种于胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB)中，28 °C 振荡培养24 h。收集细菌，并于0.01 mmol/ L 磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS，pH=7.4)中稀释至4×104CFU/ mL。LPS 和poly I:C (Sigma 公司，美国)用PBS 溶解稀释至终浓度分别为4 和2 mg/mL。将日本鳗鲡分成4 组，实验组分别腹腔注射250 μL LPS、250 μL poly I:C 和250 μL 4×104CFU/mL 嗜水气单胞菌液，对照组注射250 μL 灭菌PBS。于免疫后0、6、12、24、48 和72 h 每组随机选取4 尾的肝脏、脾脏和肾脏3 种组织器官，保存用于后续实验。

1.4 细胞培养及免疫刺激

离体实验中，按照实验室已有研究进行日本鳗鲡肝脏细胞系培养[27]。实验组细胞分别用30 μg/mL LPS、50 μg/mL poly I:C、30 μg/mL CpGDNA (Sangon Biotech，中 国)、30 μg/mL 肽聚糖(PGN,Sigma，美国) 或3 种不同浓度的嗜水气单胞菌 (1×106、1×107和 1×108CFU/mL)处理细胞，对照组用等剂量灭菌PBS 处理，每组在不同时相取4 个平行样品。按照说明书，使用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II 试剂盒在细胞处理后0、3、6、12、24 和48 h，从细胞中分离提取总RNA。

1.5 AjTBK1 全长cDNA 的克隆

按照说明书指示，使用TRIzol 试剂 (Invitrogen，美国)从日本鳗鲡组织中分离总RNA。使用肝脏RNA，用SMART RACE cDNA 扩增试剂盒(TaKaRa，日本)合成用于RACE 反应的cDNA 第一条链。基于实验室掌握的日本鳗鲡转录组数据库中的TBK1 部分序列，使用Primer premier 5.0软件进行特异性引物设计 (表1)，进行PCR 以扩增AjTBK1 的部分cDNA 序列。将纯化的PCR 产物插入pMD19-T (Simple)载体 (TaKaRa，日本)并转化至DH5α 感受态细胞中。挑取阳性克隆所得质粒由生工生物工程 (上海)股份有限公司进行DNA 测序。根据克隆的TBK1 部分基因序列，进一步设计特异性引物 (表1)，使用5′和3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(TaKaRa，日本)进行RACE PCR 扩增，扩增产物经凝胶纯化，克隆至pMD19-T (simple)载体，并按上述方法测序。

1.6 生物信息学分析

BLAST 程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列相似性分析；ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析AjTBK1 的全长cDNA 序列；ExPASy (http://www.us.expasy.org/tools/)分析推导的氨基酸序列；CLUSTALW 程序(http://www.ebi.ac.uk/clustaw/)进行多序列比对；NCBI CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)预测蛋白质结构域特征；MEGA 5 软件基于Neighbor-Joining 方法构建系统发育树。

1.7 基于qRT-PCR 的AjTBK1 表达分析

使用PrimeScript™ RT 试剂盒和gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara，日本)从总RNA 合成cDNA 第一条链。在该反应中，由试剂盒提供的gDNA Eraser (具有高效DNAase 活性)进行基因组DNA 的去除。

将合成的cDNA 用无核酸酶水稀释10 倍，于-20 °C 储存。使用Primer premier 5.0 软件设计AjTBK1 与β-actin(内参基因)的引物 (表1)，进行预实验以确保没有引物二聚体的单个离散带的扩增，并对产物进行测序以验证RT-PCR 的特异性。qRT-PCR 反应体系总体积为20 μL，包含10 μL 2×AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix、1 μL 稀释 的cDNA、正 反引物 各0.5 μL (10 μmol/L)和8 μL 无核酸酶水。于Roche Light Cycler 480 机器(Roche，英国)上进行扩增，qRT-PCR 条件：95 °C孵育1 min，随后进行40 个循环 (95 °C，15 s，60 °C，1 min)。在每个qRT-PCR 反应结束时进行扩增产物的解离分析，以确认只有一个PCR 产物被扩增和检测到。使用标准曲线评估目标基因和参考基因的相对定量。根据实验室已有研究[27]，使用比较CT法 (即2-△△CT方法)用于确定AjTBK1的mRNA 相对表达水平。基因表达水平通过平均值和标准误差标识，有3 个样品重复。

1.8 亚细胞定位

将AjTBK1 的ORF 克隆并使用相应引物插入pEGFP-N1 载体中 (表1)，构建的重组质粒通过测序确认。将HEK-293 细胞接种在6 孔板中，使用Lipofectamine 3 000 试剂 (Invitrogen，美国)转染纯化后的质粒。用转染pEGFP-N1 空载体的细胞作为对照。转染12 h 后，细胞用30 μg/mL LPS 或50 μg/mL poly I:C 处理，用 PBS 处理的细胞作为载体对照。处理 24 h 后，用PBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定，并用6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)(1 mg/mL)染色，具体方法参考文献[28]所述，在共聚焦荧光显微镜 (Leica TCS SP8)下观察细胞。

1.9 双荧光素酶活性测定

为了研究AjTBK1 对NF-κB、I 型IFN 和AP-1 启动子活性的调控作用，以pRL-TK 载体 (表达海肾荧光素酶)作为转染效率标准化的内参对照，使用Dual-Glo 荧光素酶测定系统 (Promega，美国)进行荧光素酶测定。使用相应的引物将AjTBK1 的ORF 克隆并插入表达载体pCMV-CHis 中 (Beyotime Biotechnology 公司)。HEK293 细胞在48 孔板中以每孔 1×105个细胞培养，使用Lipofectamine 3 000 试剂，转染20 ng pRL-TK 内参质 粒、100～300 ng pCMV-TBK1 和80 ng NF-κBluc 荧光素酶报告质粒 (Genomeditech，中国)或pAP1-luc (Beyotime Biotechnology，中国)或 IFN-βluc (Beijing Qualityard Biotechnology，中 国)。用pCMV-C-His 空载体转染的细胞作为对照。对于每次转染，每孔DNA 总量控制在400 ng，并用空载体进行平衡。在转染后6、12 和24 h 收获细胞并通过Promega GloMax®20/20 光度计 (Promega，美国)测量荧光素酶活性，并计算与对应的海肾荧光素酶的活性比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性，进而获得实验组与对照组荧光素酶相对活性的倍数变化[29]。

1.10 统计学分析

使用SPSS 15.0 对所得实验数据进行数据分析，其中仅两组数据间的比较使用成组T-检验分析，多组数据间的比较使用单因素方差分析及Duncan 多重比较。并用P<0.05 表示存在显著性差异，P<0.01 则表示存在极显著差异。

2 结果

2.1 AjTBK1 基因全长克隆及序列分析

日本鳗鲡AjTBK1 (GenBank 登录号：MK 681481)的cDNA 全长为3 018 bp，其中开放阅读框 (ORF)为2 196 bp，5′非编码区 (UTR)为70 bp，3′非编码区为752 bp (图1)。ORF 编码731 个氨基酸 (aa)，预测的蛋白质分子量为83.98 ku，理论等电点为6.27。SMART 程序预测AjTBK1 具有保守的结构域，包括N 端的激酶结构域 (KD，1～308 aa)，泛素样结构域 (ULD，309～387 aa)，二聚化支架结构域 (SDD，388～657 aa)和C 端结构域(CTD，658～731aa)。

图1 日本鳗鲡AjTBK1 cDNA 及推导的氨基酸序列图大写字母分别代表5′和3′非编码区序列，小写字母代表编码区序列；上面为核苷酸序列，对应下面为编码的氨基酸序列；起始密码子(atg)以加粗及单下划线标示，终止密码子(tga)以加粗标示，多腺苷酸化信号(ATTAAA)以双下划线标示；激酶结构域(KD)灰色标示，泛素样结构域(ULD)为加粗斜体标示，二聚化支架结构域(SDD)用单线标示，C 端结构域(CTD)用方框标示。Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of AjTBK1 gene from A. japonicaCapital letters represent the sequence of 5' and 3' untranslated region separately.Lowercase letters represent the coding sequence,with nucleotide sequence above and coded amino sequence below.The start codon (ATG) was underlined in bold,and the stop codon (TAA) was marked with an asterisk in bold.The polyadenylation signal (ATTAAA) is double-underlined.The kinase domain (KD) was shaded in grey.The ubiquitin-like domain (ULD)was italic in bold.The scaffold dimerization domain (SDD) was underlined.The C-terminal domain (CTD) was boxed.

2.2 AjTBK1 蛋白的结构分析

氨基酸多重比较图显示，日本鳗鲡AjTBK1与斑马鱼、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、小鼠、智人 (Homo sapiens)等其他物种TBK1 氨基酸序列一样，含有保守的激酶结构域、泛素样结构域、二聚化支架结构域以及C 端结构域。激酶结构域中的ATP 结合位点“LGQGATANV”用方框标记，而与TBK1 自磷酸化密切相关的丝氨酸残基Ser172 高度保守。同源性分析显示，AjTBK1 与其他物种TBK1 氨基酸序列一致性高达66%～87% (图2)。

(图2 Fig.2)

采用SWISS-MODEL 软件 (http://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模，以人TBK1 蛋白质三维结构为模板 (PDB 编号：4imo.1.A)预测日本鳗鲡AjTBK1 蛋白质三级结构。预测所得的AjTBK1三维结构由19 个α 螺旋和13 个β 折叠组成，并且与人TBK1 的三维结构高度相似 (图3)。

图3 AjTBK1 与人类TBK1 空间结构的比较(a)AjTBK1 三维结构图；(b)人TBK1 三维结构图；(c)日本鳗鲡与人TBK1 叠合的三维结构图。Fig.3 TBK1 three-dimensional structure comparison between A. japonica and H. sapiens(a) the predicted three-dimensional structure of AjTBK1;(b) the predicted three-dimensional structure of human TBK1;(c) the predicted three-dimensional structure of AjTBK1 overlapped with human TBK1.

2.3 系统发育分析

使用Mega 5.0 中的Neighbor-Joining 方法构建了其系统发育树 (图4)。系统发育树显示，日本鳗鲡AjTBK1 与亚洲龙鱼 (Scleropages formosus)邻近，并与其他硬骨鱼类TBK1 聚为一个分支，而哺乳类、鸟类及两栖类TBK1 则各聚为一支。

图4 日本鳗鲡AjTBK1 与其他物种TBK1 氨基酸序列系统发育树(AjTBK1 用▲)Fig.4 Phylogenetic tree of the TBK1 amino acid sequences between A. japonica and other species(AjTBK1 was marked with ▲)

2.4 AjTBK1 基因在日本鳗鲡不同组织中的表达

AjTBK1 在日本鳗鲡肝脏、肠、腮、脾脏、皮肤、肾脏、心脏和肌肉中均有表达，其中在肝脏中表达量最高，肠、鳃和脾脏中表达量也较高，而心脏和肌肉中的表达量相对较低 (图5)。

图5 健康日本鳗鲡不同组织中AjTBK1 的相对表达量1.肝脏，2.肠，3.鳃，4.脾脏，5.皮肤，6.肾脏，7.心脏，8.肌肉；不同的字母表示不同组织AjTBK1 基因表达水平存在显著差异(P<0.05)。Fig.5 Relative expression levels of AjTBK1 transcripts in different tissues of healthy A. japonica1.liver,2.intestine,3.gills,4.spleen,5.skin,6.kidney,7.heart,8.muscle;different letters indicated a significant difference of AjTBK1 gene expression among tissues (P<0.05).

2.5 免疫刺激对肝脏、肾脏和脾脏中AjTBK1基因表达的影响

为了研究AjTBK1 在抗细菌和抗病毒免疫应答中的作用，我们通过qRT-PCR 分别检测了经LPS，poly I:C 和嗜水气单胞菌刺激日本鳗鲡0、6、12、24、48 和72 h 后，日本鳗鲡肝脏、肾脏和脾脏中AjTBK1 基因表达水平。

LPS 刺激后，日本鳗鲡肝脏AjTBK1 基因表达水平在6 h 显著上升至峰值 (1.8 倍，P<0.01)，而在24 h 表达量显著降低 (0.71 倍，P<0.05)；肾脏AjTBK1 基因表达水平在48 h (0.61 倍，P<0.05)和72 h (0.51 倍，P<0.05)均显著降低；脾脏AjTBK1 基因表达水平在6 h (0.65 倍，P<0.01)和12 h (0.72 倍，P<0.01)显著降低 (图6-a)。

图6 LPS、poly I:C 及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡肝脏、肾脏及脾脏AjTBK1 基因表达水平的影响(a) LPS 刺激对日本鳗鲡肝脏、肾脏及脾脏AjTBK1 基因表达水平的影响；(b) poly I:C 刺激对日本鳗鲡肝脏、肾脏及脾脏AjTBK1 基因表达水平的影响；(c) A. hydrophila 刺激对日本鳗鲡肝脏、肾脏及脾脏AjTBK1 基因表达水平的影响；各图横坐标中1，2 和3 分别代表日本鳗鲡肝脏，肾脏和脾脏；“*”表示相同时相实验组与对照组之间存在显著差异(P<0.05)，“**”表示极显著差异(P<0.01)。Fig.6 Effect of LPS,poly I:C,or A. hydrophila on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica(a) Effect of LPS on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;(b) effect of poly I:C on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;(c) effect of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression in the liver,kidney,and spleen of A. japonica;1,2 and 3 on the abscissa represent liver,kidney and spleen respectively;statistical differences between the expression level of each sample and that of the PBS control at the same sampling time are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01).

poly I:C 免疫后，日本鳗鲡肝脏AjTBK1 基因表达水平在6 h 显著升高并达到峰值 (1.8 倍，P<0.01)；肾脏AjTBK1 基因表达水平在48 h (0.56倍，P<0.01)和72 h (0.62 倍，P<0.05)显著降低；脾脏AjTBK1 基因表达水平在24 h (1.4 倍，P<0.01)显著提高，在6 h (0.82 倍，P<0.05)和72 h(0.81 倍，P<0.05)显著降低 (图6-b)。

嗜水气单胞菌感染后，日本鳗鲡肝脏AjTBK1 基因表达水平在48 h (1.9 倍，P<0.01)和到72 h (1.6 倍P<0.01)显著上升；肾脏AjTBK1 基因表达水平在12 h (1.9 倍，P<0.05)和24 h (1.6 倍，P<0.01)表达量显著上调；脾脏AjTBK1 基因表达水平在24 h (1.2 倍，P<0.05)出现显著上升，但在6 h (0.87 倍，P<0.01)和72 h (0.66 倍，P<0.01)显著降低 (图6-c)。

2.6 不同PAMPs 及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1 基因表达的影响

为进一步研究离体状态下不同病原体相关分子模式 (PAMPs)及鱼类病原菌对TBK1 基因表达的影响，我们用LPS、poly I:C、CpG-DNA、PGN 以及不同浓度的嗜水气单胞菌刺激日本鳗鲡肝脏细胞系，在0、3、6、12 h、24 和48 h 通过qRTPCR 检测AjTBK1 基因表达水平变化。

日本鳗鲡肝脏细胞系经LPS 刺激后，AjTBK1 基因表达水平在6 h 表达显著下降 (0.55 倍，P<0.05)，在12 h (15.3 倍，P<0.01)和48 h (1.9 倍，P<0.05)显著升高；poly I:C 处理后，AjTBK1 基因表达量在12 h (5.8 倍，P<0.05)显著提高；PGN刺激后的AjTBK1 mRNA 表达水平在3 h (0.58 倍，P<0.05)显著降低，在6 h (9.3 倍，P<0.01)，12 h(4.8 倍，P<0.01)，24 h (1.4 倍，P<0.05)和48 h(1.7 倍，P<0.01)均显著升高；而CpG-DNA 刺激下的基因表达水平在各时相均无显著变化 (P>0.05) (图7-a)。

图7 不同PAMPs 及不同浓度嗜水气单胞菌刺激对日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1 基因表达水平的影响(a) 不同PAMPs 刺激对日本鳗鲡肝脏细胞内AjTBK1 基因表达水平的影响；(b) 不同浓度嗜水气单胞菌刺激对日本鳗鲡肝脏细胞内AjTBK1基因表达水平的影响；“*”表示相同时相实验组与对照组之间存在显著差异(P<0.05)，“**”表示极显著差异(P<0.01)。Fig.7 Effect of different PAMPs,or different concentrations of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells(a) Effect of different PAMPs on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells;(b) effect of different concentrations of A. hydrophila on AjTBK1 gene expression of A. japonica liver cells;statistical differences between the expression level of each sample and that of the PBS control at the same sampling time are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01).

日本鳗鲡肝脏细胞系经浓度为1×106CFU/mL嗜水气单胞菌刺激后，AjTBK1 基因表达水平在24 h (2.7 倍，P<0.05)和48 h (4.7 倍，P<0.01)显著上调；当嗜水气单胞菌浓度调整为1×107CFU/mL 后，AjTBK1 基因表达水平在6 h (0.74 倍，P<0.05)和12 h (0.50 倍，P<0.01)显著下降，但在48 h (2.1 倍，P<0.01)显著提高；浓度为1×108CFU/mL 嗜水气单胞菌刺激后，AjTBK1 基因表达水平48 h (1.6 倍，P<0.01)显著升高 (图7-b)。

2.7 AjTBK1 在HEK293 细胞中的亚细胞定位

构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1 重组质粒，以pEGFP-N1 空载体为对照，将其转染人类HEK293细胞进行表达。天然状态下，AjTBK1 在细胞质中均匀分布，在细胞核中未见分布。LPS 和poly I:C 刺激下，AjTBK1 在细胞质中出现聚集、并呈点状分布 (图版)。

图版 AjTBK1 在HEK293 中的亚细胞定位1～3.天然状态下绿色荧光蛋白亚细胞定位；4～6.天然状态下AjTBK1 绿色荧光融合蛋白亚细胞定位；7～9.LPS 刺激后AjTBK1 绿色荧光融合蛋白亚细胞定位；10～12.polyI:C 刺激后AjTBK1 绿色荧光融合蛋白亚细胞定位；蓝色部分为DAPI 染色，示细胞核；绿色部分为绿色荧光蛋白，示EGFP 或EGFP-AjTBK1 在细胞中的位置；3、6、9 和12 分别为1 和2、4 和5、7 和8、9 和10 的合并图像。Plate Subcellular localization of AjTBK1 intransfected HEK293 cells1-3.subcellular localization of EGFP protein in the natural state;4-6.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein in the natural state;7-9.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein after LPS stimulation;10-12.subcellular localization of EGFP-AjTBK1 fusion protein after poly I:C stimulation;nucleus were stained with DAPI,were shown in blue;the green part shows the location of EGFP or EGFP-AjTBK1 in cells;3,6,9 and 12 are the merged images of 1 and 2,4 and 5,7 and 8,9 and 10 respectively.

2.8 AjTBK1 过表达对 NF-κB、IFN1 和 AP1启动子活性的影响

为研究AjTBK1 对NF-κB、AP-1 和I 型IFN信号通路的调控作用，我们构建了AjTBK1 的真核表达质粒pCMV-TBK1，同时以pCMV-C-His 为对照质粒，pRL-TK 为内参质粒，将pCMV-TBK1分别与NF-κB，AP-1 或IFN-β 启动子荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 细胞。双荧光素酶检测结果显示，过表达的AjTBK1 对NF-κB、AP-1、IFNβ 启动子活性具有激活作用并呈剂量依赖性 (图8)。

图8 过表达AjTBK1 对NF-κB，AP-1 和IFN-β 的激活作用(a) 不同时相下AjTBK1 对NF-κB 的激活；(b)不同转染剂量的AjTBK1 转染24 h 对NF-κB 的激活；(c)不同时相下AjTBK1 对AP-1 的激活；(d)不同转染剂量的AjTBK1 转染12 h 对AP-1 的激活；(e)不同时相下AjTBK1 对IFN-β 的激活；(f)不同转染剂量的AjTBK1 转染24 h 对IFN-β 的激活。图(b)、(d)、(f)中的1、2、3、4 分别代表转染pCMV 300 ng、转染pCMV 200 ng 和pCMV-TBK1 100 ng、转染pCMV 100 ng 和pCMV-TBK1 200 ng、转染pCMV-TBK1 300 ng。“*”表示相同时相下实验组与对照组之间存在显著差异(P<0.05)，“**”表示极显著差异(P<0.01)；“＃”表示不同转染剂量的实验组之间存在显著差异(P<0.05)，而“##”表示极显著差异(P<0.01)。Fig.8 Activation of NF-κB,AP-1,and IFN-β response by AjTBK1 overexpression(a) activation of NF-κB by AjTBK1 in different phases;(b) activation of NF-κB by different doses of AjTBK1 after 24 h transfection;(c) activation of AP-1 by AjTBK1 in different phases;(d) activation of AP-1 by different doses of AjTBK1 after 12 h transfection;(e) activation of IFN-β by AjTBK1 in different phases;(f) activation of IFN-β by different doses of AjTBK1 after 24 h transfection;1,2,3,4 in Fig B,D,F are referred to the plasmid transfection of 300 ng pCMV,200 ng pCMV and 100 ng pCMV-TBK1,100 ng pCMV and 200 ng pCMV-TBK1,and pCMV-TBK1 300 ng,respectively;statistical differences between the expression level of each sample and that of the pCMV control are indicated with asterisks (*,P<0.05;**,P<0.01);hashtags indicate statistically significant differences between two transfection doses of AjTBK1 as specified in the figure (#,P<0.05;##,P<0.01).

过表达的AjTBK1 分别在6 h (1.7 倍，P<0.01)、12 h (1.6 倍，P<0.01)和24 h (1.8 倍，P<0.01)显著增强了NF-κB 启动子荧光素酶活性 (图8-a)；选取24 h 作为转染时间，将NF-κB 报告质粒与不同剂量的pCMV-TBK1 质粒 (100 ng、200 ng 和300 ng)共转染，发现NF-κB 启动子的荧光素酶活性分别提高了1.5 倍 (P<0.01)，1.7 倍 (P<0.01)和2.4倍 (P<0.01) (图8-b)。

过表达的AjTBK1 在6 h 对AP-1 启动子无显著诱导 (P>0.05)，而在12 h (1.2 倍，P<0.01)和24 h (1.1 倍，P<0.01)均能诱导AP-1 启动子荧光素酶活性 (图8-c)；当与不同剂量的pCMV-TBK1质粒 (100 ng 和300 ng)共转染时，AP-1 启动子的荧光素酶活性在12 h 分别提高了1.03 倍 (P<0.01)和1.13 倍 (P<0.01)，而在200 ng 剂量下无显著诱导效果 (P>0.01) (图8-d)。

过表达的AjTBK1 在6 h (1.4 倍，P<0.01)，12 h (1.91 倍，P<0.01)和24 h (1.92 倍，P<0.01)显著诱导IFN-β 启动子荧光素酶活性 (图8-e)；选取24 h 作为转染时间，将报告质粒IFN-β 与不同剂量的pCMV-TBK1 质粒 (100 ng、200 ng 和300 ng)共转染时，IFN-β 启动子的荧光素酶活性分别提高了1.46 倍 (P<0.01)，1.47 倍 (P<0.01)和1.48倍 (P<0.01) (图8-f)。

3 讨论

哺乳动物TBK1 作为非经典IκB激酶，在激活NF-κB、I 型IFN 信号通路中起着关键作用[30]。目前的研究表明，鱼类TBK1 在IRF3/IRF7 介导的I 型干扰素信号通路具有重要的调控作用，但有关鱼类TBK1 对细菌免疫应答密切相关的NFκB 及MAPK 信号通路调控作用的研究还未见报道。为了深入了解TBK1 在硬骨鱼类免疫应答中的作用机制，本研究从日本鳗鲡中克隆了AjTBK1 cDNA 全长，探究了在体和离体状态下主要病原模式分子和鱼类病原菌刺激后的AjTBK1 基因表达的变化，以及AjTBK1 过表达对于不同免疫相关信号通路的调控作用。

AjTBK1 编码了731 个氨基酸，与斑点叉尾鮰、斑马鱼、大西洋鳕、虹鳟等TBK1 氨基酸相似度高达84%～87%，具有TBK1 蛋白家族典型的激酶结构域 (KD)、泛素样结构域 (ULD)、二聚化支架结构域 (SDD)以及C 端结构域 (CTD)[1,31]。AjTBK1 的激酶结构域中含有保守的ATP 结合位点“LGQGATANV”，以及与TBK1 自磷酸化密切相关的丝氨酸残基Ser172。此外，日本鳗鲡AjTBK1 空间结构与人类TBK1 蛋白质在三维结构上高度相似，并与其他鱼类TBK1 在系统发育树中聚为一支，反映出TBK1 在进化过程中相对保守，预示该分子具有类似于哺乳动物TBK1 的免疫调节方面的功能。

AjTBK1 基因在日本鳗鲡各组织中广泛表达，这种组成型基因表达模式也出现在大西洋鳕[12]、青鱼[13]、草鱼[14]、大黄鱼[15]、斜带石斑鱼[17]和鲤[18]中。AjTBK1 基因在肝脏、肠、鳃、脾脏等免疫相关组织中有较高表达，与大西洋鳕[12]、草鱼[14]和鲤[18]的研究结果一致。但也有学者发现大黄鱼TBK1 基因表达水平在脑、肌肉和心脏中较高[15]，而斜带石斑鱼心脏TBK1 表达量明显高于肝脏、脾脏、头肾等免疫器官[17]，提示TBK1 在硬骨鱼类中的表达模式具有种属特异性，其免疫功能也可能存在差异。

硬骨鱼类TBK1 在抗病毒免疫功能中的研究已有不少报道。例如鲤春病毒血症病毒 (SVCV)、草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)可诱导青鱼肝脏、脾脏、肾脏以及青鱼鳍细胞中TBK1基因表达水平显著提高[13]，GCRV 感染草鱼后，其脾脏、头肾以及肾脏细胞中TBK1 表达量显著上升[14]，而赤点石斑鱼神经坏死病毒 (RGNNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒 (SGIV)感染后可使斜带石斑鱼脾脏细胞中TBK1 表达量显著升高[17]。本实验发现poly I:C可诱导日本鳗鲡肝脏、脾脏以及日本鳗鲡肝脏细胞中AjTBK1 表达水平显著提高，表明AjTBK1 参与日本鳗鲡抗病毒免疫应答，但其免疫调控机制尚需进一步研究。

目前，有关鱼类TBK1 参与抗病原菌感染的研究仅在大黄鱼中有所报道，其结果显示，灭活的副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)可以诱导大黄鱼免疫相关组织中TBK1 的表达水平提高[15]。我们发现养殖鳗鲡主要病原菌嗜水气单胞菌能够诱导日本鳗鲡肝脏、脾脏、肾脏以及日本鳗鲡肝脏细胞TBK1基因表达水平显著升高，从在体和离体两个方面支持了鱼类TBK1 在抗细菌免疫应答反应中的重要作用。此外，我们还发现革兰氏阴性和阳性细菌的主要病原模式分子LPS 和PGN均能引起日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1 的表达水平提高，与草鱼肾脏细胞的研究结果相符[14]。但也有学者发现青鱼鳍细胞TBK1 的表达水平经LPS刺激后却无显著变化[13-14]，提示不同鱼类细胞对于不同的主要病原模式分子刺激后的免疫应答机制有所不同。

亚细胞定位对于蛋白质功能的深入研究具有重要意义。天然状态下AjTBK1 主要分布于细胞质中，与青鱼[13]、斜带石斑鱼[17]的研究结果相一致。目前，尚未有研究表明病原体相关分子模式能够引起TBK1 在细胞中的定位变化，而本研究证实了LPS 和poly I:C 能够引起AjTBK1 在细胞质中聚集表达，与日本鳗鲡AjIKKα 的文献报道一致[32]，提示AjTBK1 对抗病原微生物免疫应答的调控作用主要在细胞质中进行。哺乳动物中的研究表明，IKKα/β 可以通过磷酸化对TBK1/IKKε 进行活化以完成抗病毒信号的进一步传递[33]，日本鳗鲡AjTBK1 与AjIKKα 在抗细菌和抗病毒先天免疫应答中是否也存在类似的相互作用机制还有待进一步研究。

TBK1 是调节IFN-β 表达的重要激酶，在介导人类先天免疫中具有不可替代的作用[34]。与人类TBK1 功能相似，草鱼[14]、青鱼[19]以及斑马鱼[16]等硬骨鱼类的TBK1 过表达后也能激活自身I 型IFN 的表达。此外，硬骨鱼类TBK1 也被证明与IRF 家族中多个转录因子如IRF3、IRF5、IRF6、IRF7 之间存在相互作用，并可通过这些相互作用参与调节I 型IFN 信号通路[19-20,35-37]。本实验中AjTBK1 过表达显著激活IFN-β 的启动子活性，并呈剂量依赖性进一步证明鱼类TBK1 在抗病毒免疫功能方面的保守性。此外，在绿头鸭和原鸡中的研究发现缺失KD 或ULD 的TBK1 的突变体丧失了对IFN-β 的激活能力[38-39]，而缺失KD 的斜带石斑鱼TBK1 的突变体也缺乏对IRF3、IRF7 启动子活性的激活能力[17]，因此，进一步通过构建日本鳗鲡TBK1 不同结构域突变体，研究其对IFNβ 的启动子活性的影响，将有助于深入了解TBK1所介导的抗病毒调控机制。

NF-κB 是细胞中的关键核转录因子，可参与调节细胞内多种免疫和炎症反应。虽然人类TBK1 和绿头鸭TBK1 的过表达可激活NF-κB 的启动子活性[10,38]，但硬骨鱼类TBK1 是否参与调节NF-κB 信号通路尚未见报道。本实验通过双荧光素酶检测发现，AjTBK1 过表达显著增强了NFκB 启动子荧光素酶活性，并呈现剂量依赖性，表明鱼类TBK1 也参与了细胞内NF-κB 信号通路的激活，但其调控机制尚需进一步研究。

AP-1 属于MAPK 信号通路中的重要细胞因子，其转录活性在细胞增殖、凋亡、炎症及迁移等过程中发挥复杂而又重要的作用，且受JNK、ERK、p38 MAPK、PI3K/AKT 的调控[40]。早期的研究表明，哺乳动物中AKT 可调控MAPK 信号通路下游因子AP-1，TBK1 可通过激活P13K 实现对AKT 的磷酸化[40-41]。我们首先在日本鳗鲡中观察到TBK1 能够对AP-1 启动子荧光素酶活性有一定的增强作用，提示硬骨鱼TBK1 很可能也参与了对MAPK 信号通路的调控作用，但尚需在其他鱼类中进一步证实。

本实验从日本鳗鲡克隆鉴定出AjTBK1 基因的cDNA 全长，qRT-PCR 显示嗜水气单胞菌和poly I:C 能够诱导日本鳗鲡肝脏、脾脏以及日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1 基因水平显著提高，亚细胞定位结果显示，经LPS 和poly I:C 刺激后AjTBK1在细胞质中呈聚集点状分布，双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1 可激活NF-κB、AP-1 和IFN-β 启动子，以上结果表明，AjTBK1 是激活NF-κB、I 型IFN 和MAPK 信号通路中的正调节剂，在机体抗细菌和抗病毒免疫应答中发挥重要的调控作用。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）