维生素E 对虎龙杂交斑生长、抗氧化及免疫功能的影响

翟浩云，张 璐，蔡亲晓，周智愚，殷浩然，耿丽娜，吴小易

(海南大学，南海海洋国家资源与利用国家重点实验室，海南省热带水生生物技术研究重点实验室，海南 海口 570228)

维生素E(VE)被称为动物体内最重要的脂溶性抗氧化剂，是维持鱼类血液质量、免疫力、毛细血管通透性、心肌健康、红细胞膜免疫和保护白细胞功能不可缺少的营养物质[1-2]。目前已确定了多种养殖鱼类对VE的需求量(30～200 mg/kg 饲料)[3]。饲料中缺乏VE会导致动物白肌纤维萎缩、坏死和毛细血管渗透性增加、肌肉退化、心脏和肌肉等组织水肿、贫血、红细胞生成障碍、褪色和肝脏蜡样沉着等症状[3]。虹鳟(Oncorhynchusmykiss) 摄食低水平的VE饲料后，肌肉中微粒体比鳃、心脏或肝脏中更容易产生过氧化反应，说明饲料VE的含量对微粒体过氧化程度有影响[4]。Lin 等[5]对玛拉巴石斑鱼 (Epinephelus malabaricus)研究发现，摄食高VE水平饲料可以提高鱼血细胞数量、白细胞呼吸爆发活力、血浆溶酶体和补体活性。Gatlin 等[6]的研究表明，饲料VE水平升高能够抑制饲料脂肪氧化。有研究发现，VE也可降低草鱼(Ctenopharyngodonidella)和白姑鱼(Argyrosomusregius)体内的脂质过氧化[7-8]。然而，饲料中添加过量的VE也会引起鱼类生长性能下降等副作用，这可能是由于体内自由基失衡和VE摄入过多起到促进氧化作用导致的[9-10]。Wang 等[11]的研究表明，当饲料中VE超过300 mg/kg 时，VE在体内不再作为抗氧化剂，反而起到促氧化剂的作用。综上表明，饲料中添加适量的VE可以促进鱼类健康生长。

虎龙杂交斑(E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)是棕点石斑鱼母本和鞍带石斑鱼父本杂交产生的子一代石斑鱼。该鱼种具有生长快速和适应性强的特点，在全球水产养殖业中具有巨大的发展潜力[12]。目前，对虎龙杂交斑VE需求量的研究未见报道，因此，本实验通过设计不同VE水平的饲料投喂虎龙杂交斑，研究VE对虎龙杂交斑生长性能、免疫及抗氧化功能的影响，从而确定虎龙杂交斑饲料中最适的VE需求量，以期补充完善虎龙杂交斑营养需求数据库。

1 材料与方法

1.1 实验设计及饲料配方

本实验饲料配方参考已有研究中的虎龙杂交斑基本营养信息[13-15]，以鱼粉、鸡肉粉和大豆分离蛋白为主要蛋白源，以鱼油为主要脂肪源设计了6 组等能(340 kcal/100 g)等蛋白(占干物质51%)等脂肪(占干物质9%)饲料，分别添加0、35、70、105、250、500 mg/kg VE粉末(50%)，通过高效液相色谱法(HPLC)[16](沃特世2690 系统，美国)测得饲料VE含量分别为4.1、26.3、40.7、57.1、116.8、209.6 mg/kg。饲料配方及主要成分见表1。将所有原料用搅拌机混合均匀后放入压条机(F-75 型双螺旋杆挤条机，中国)压条，制成直径3 mm 的条状饲料后，放入制粒机(G-500 型造粒机，中国)制粒。所有饲料在25 ℃阴干后过筛，置于-20 ℃保存。

表1 实验饲料配方及成分分析(干重)Tab.1 Formulations and analyzed composition of experimental diets (dry-matter basis)

1.2 生长实验

本实验所用虎龙杂交斑购买于海南省临高县的一个商业孵化场。生长实验前用商业饲料对实验鱼驯化养殖13 d。实验鱼适应养殖环境后随机放于18 个网箱(长130 cm×宽80 cm×高50 cm)组成的流水养殖系统中，初始重量为(14.22±0.01) g，每组饲料3 个重复，每个重复12 尾鱼。实验鱼每日饱食投喂2 次(08：00 和16：30)，并记录摄食量，实验周期为8 周。实验期间，每周清理1 次养殖池，测得水中溶解氧含量为5.8～6.8 mg/L，氨氮含量为0～0.2 mg/L，水温保持在29～31 ℃。海水盐度为33.1。

1.3 铜胁迫实验

生长实验结束后，每组各取7 尾实验鱼进行72 h 铜胁迫实验，以五水硫酸铜为铜源，铜离子浓度为3.5 mg/L，实验期间密切观察鱼的活动状态，及时记录死亡情况并清理死鱼。

1.4 样品采集

生长实验开始前，从暂养鱼中取10 尾与实验鱼规格相同的鱼作为初始鱼样本并于-20 ℃储存，供后续分析相关指标。生长实验期间每周进行一次称重并记录实验鱼生长情况。生长实验结束后，将实验鱼饥饿24 h，统计每个网箱实验鱼存活尾数、总重以及投喂的饲料总重，计算存活率、增重率和饲料系数。取样前用MS-222 将鱼麻醉，每个实验组中随机取2 尾鱼于-20 ℃保存，用于全鱼组成分析，另取3 尾鱼分别记录其体重和体长，用肝素钠浸润的1 mL 针管尾静脉取血，在4 ℃，3 000 r/min 下离心15 min，吸取上清液血清，-80 ℃保存备用。后采集肌肉、腹腔脂肪、肝脏、肠道称重并记录，用于计算肝体比(HSI)、肠系膜脂肪体比(IPF)、肥满度(CF)等指标，解剖时取头肾、肝脏和肌肉等样品用于组分分析和分子生物学分析，所有样品采集并称重记录后置于液氮罐中暂存，后置于-80 ℃储存。铜胁迫实验后，统计各组实验鱼存活情况，计算存活率，每组各取3 尾鱼，采集头肾用于分子生物学分析。本研究获得了海南大学动物伦理委员会批准（批准文号：HNUAUCC-2021-00032），实验过程中操作人员严格遵守海南大学动物伦理规范，并按照海南大学动物伦理委员会制定的规章制度执行。

1.5 生长指标计算

增重率(WG，%)=(末均重-初始均重)/ 初始均重×100%

饲料转化率(FCR)=摄食量(g)/ 增重(g)

肝体比(HSI，%)=肝脏重(g)/鱼重(g) × 100%

肠系膜脂肪体比(IPF，%)=肠系膜脂肪重(g)/体重 (g) ×100%

肥满度(CF，%)=体重 (g)/ [体长 (cm)]3×100%

1.6 样品测定与分析

用杜马斯燃烧法快速定氮仪(Elementar,德国)测定全鱼和肌肉的粗蛋白含量，用全自动脂肪仪(ANKOMx715 自动脂肪仪，美国)测定全鱼和肌肉的粗脂肪含量。肌肉样品在烘箱中 125 ℃烘干3 h，全鱼样品在烘箱中125 ℃烘干24 h，按照减重法计算水分含量。

用Elisa 试剂盒测定血清溶菌酶和血清免疫球蛋白(CUSABIO，武汉华美生物工程有限公司)，肝脏和肌肉VE含量(AMEKO，上海联硕生物科技有限公司)与总抗氧化能力(SAB，美国)。

1.7 总RNA 的提取与反转录

从-80 ℃冰箱中取出肝脏和头肾样品，使用TRIzol 试剂(Invitrogen，美国)提取总RNA。提取完成后用1.0%变性琼脂糖凝胶进行质量测定，看是否有杂条带产生，确认无污染后用仪器Nano-Drop®ND-1000(Thermo Fisher Scientific，美国)进行浓度测定。通过Prime ScriptTM RT reagen Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,日本)进行反转录建立cDNA 文库。具体方法参照He 等[17]。

1.8 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析

在定量热循环仪RT-PCR(QuantStudio 6 Fle,Applied Biosystem,新加坡)中进行qRT-PCR 分析。实验反应总体系和程序参考He 等[17]。根据已发表的相关鱼类目的基因序列，采用Primer premier 5.0 软件设计tor、s6k1、nrf2 和keap1 的PCR 引物对(表2)。在每次PCR 反应结束时，对扩增产物进行熔解曲线分析，以确认这些反应中存在单一PCR 产物。将cDNA 样品用5 种不同稀释倍数(3 个重复)制作标准曲线，并根据公式分析扩增效率：E=10(-1/slope)-1。采用 Livak 描述的2-△△CT方法计算目的基因的表达水平[18-19]。

表2 实时荧光定量基因表达引物序列Tab.2 Primers used for qRT-PCR

1.9 数据统计分析

由于单因素方差分析(One-Way ANOVA)难以对营养素需求量实验中得到的定量数据进行准确地统计分析[3]，因此，本研究采用折线模型[19-20]来模拟和分析各项实验指标，以增重率(WG)和总抗氧化能力(T-AOC)为评价指标分别计算实验鱼饲料中维生素E 的最适需求量。

2 结果

2.1 生长性能、形态学和饲料利用

养殖8 周后，不同VE水平饲料对实验鱼增重率有显著影响，摄食57.1 mg/kg VE饲料的实验组增重率显著高于摄食4.1 mg/kg VE饲料的实验组(P<0.05)(表3)。各组实验鱼的HSI、IPF、CF和FCR 均无显著差异(P>0.05)。以WG 为评价指标，经二次折线模型分析得出在本实验条件下虎龙杂交斑饲料中最适VE水平为62.92 mg/kg(图1)。

图1 饲料维生素E 水平与虎龙杂交斑增重率的关系Fig.1 Relationship of WG of hybrid grouper juveniles with different dietary VE levels

表3 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑生长性能和饲料利用的影响Tab.3 Effects of dietary VE levels on growth performance and feed utilization of hybrid grouper juveniles

2.2 全鱼和肌肉组成分析

不同VE水平饲料对虎龙杂交斑全鱼、肌肉的水分、粗蛋白和粗脂肪含量均无显著影响(P>0.05)(表4)。

表4 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑全鱼和肌肉组成的影响(湿重)Tab.4 Effects of dietary VE levels on whole-body and white muscle compositions of hybrid grouper juveniles(fresh weight base) %

2.3 肝脏总抗氧化能力(T-AOC) 和组织VE 含量

肝脏T-AOC 和VE含量均受饲料VE水平影响 (P<0.05)，摄食57.1 mg/kg VE饲料实验组鱼TAOC 高于摄食4.1 mg/kg VE饲料。摄食4.1 mg/kg VE饲料实验鱼肝脏VE含量低于摄食209.6 mg/kg VE饲料实验鱼。各组实验鱼肌肉VE含量之间无显著差异。以T-AOC 为评价指标，经二次折线模型分析得出在本实验条件下虎龙杂交斑饲料中最适VE水平为86.25 mg/kg(图2)。

图2 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑肝脏总抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of dietary VE levels on T-AOC of liver of hybrid grouper juveniles

2.4 血清免疫指标

各组实验鱼血清免疫指标结果表示，摄食57.1 mg/kg VE饲料实验鱼血清溶菌酶(LZM)浓度高于摄食4.1 mg/kg VE饲料实验鱼，其血清免疫球蛋白(IgM)浓度也高于摄食4.1 和209.3 mg/kg VE饲料，LZM 和IgM 浓度都呈先升高后降低的趋势(P<0.05)(表5)。

表5 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑幼鱼血清溶菌酶(LZM)，免疫球蛋白(IgM)，肝脏总抗氧化能力(T-AOC)和肝脏肌肉维生素E 含量的影响Tab.5 Effects of dietary VE levels on serum LZM,IgM,T-AOC of liver and liver vitamin E concentration of hybrid grouper juveniles

2.5 铜胁迫存活率

在铜胁迫72 h 后，各实验组鱼存活率结果显示，摄食4.1 mg/kg VE饲料实验鱼存活率低于摄食40.7、57.1、和116.8 mg/kg VE饲料实验鱼(P<0.05)(图3)。

图3 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑铜胁迫72 h 存活率的影响Fig.3 Effects of dietary VE levels on Cu2+ challenge survival of hybrid grouper for 72 h

2.6 肝脏tor、s6k1 基因和头肾nrf2、keap1基因表达

在铜胁迫后，摄食40.7 mg/kg VE饲料实验鱼头肾nrf2 基因相对表达量高于摄食4.1、26.3 和116.8 mg/kg VE饲料实验鱼(表6)。经二次折线模型分析，饲料VE水平对肝脏s6k1 基因和头肾keap1 基因相对表达量有显著影响(P<0.05) (图4)。

图4 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑头肾 keap1(a)和肝脏 s6k1(b)基因相对表达量的影响Fig.4 Effects of dietary VE levels on relative expression of head kidney keap1 (a) and liver s6k1 (b) of hybrid grouper

表6 饲料维生素E 水平对虎龙杂交斑幼鱼肝脏s6k1、 tor 和头肾keap1、 nrf2 基因相对表达量的影响Tab.6 Effects of dietary vitamin E levels on relative expression of hepatic s6k1,tor and head kidney keap1,nrf2 of hybrid grouper juveniles

3 讨论

3.1 饲料维生素E 含量对虎龙杂交斑生长性能和饲料利用的影响

VE是鱼类生长发育和维持自身健康的必需营养素，鱼类自身不能合成VE，必须从外界摄取。VE可以保护细胞免受活性氧和其他自由活性集团的损害，从而避免了膜磷脂中不饱和脂肪酸和关键蛋白质被氧化[3]。饲料中VE的缺乏和过量均会导致生长缓慢，这可能是由于鱼体内累积过多的脂质过氧化物造成的。因为脂质过氧化特别是多不饱和脂肪酸的氧化会导致动物机体损伤严重。摄入过多的VE还会影响其他脂溶性维生素的吸收[21-24]。在本实验中，当饲料中添加57.1 mg/kg VE时，实验鱼生长速率显著高于摄食4.1 mg/kg VE饲料的实验鱼，这表明饲料中添加适量的VE可以提高虎龙杂交斑的生长性能；但随着VE水平的持续升高，虎龙杂交斑的WG 较适宜添加水平有所下降。

本研究中，饲料VE水平对饲料转化率(FCR)无显著影响，这与前人在白姑鱼[7]和日本鳗鲡(Anguillajaponica)[25]中报道的实验结果相同。但也有研究发现，饲料VE水平会显著影响饲料效率[26]，但这种影响仅发生在一定的VE添加量范围内，不是严格意义上的剂量依赖性改变[27]。即饲料VE水平对饲料效率的影响也会因不同品种而产生变化。WG 是水生动物营养研究中最常用的评价指标[3]，可以直接体现饲料对鱼类生长性能的影响。经二次折线模型分析，本实验条件下虎龙杂交斑幼鱼饲料中最适VE水平为62.92 mg/kg，这与在玛拉巴石斑鱼[5]研究中的到的结果(61～68 mg/kg)相似。为减少用单一评价指标的局限性，考虑到VE在体内最主要的抗氧化作用，我们选择了总抗氧化能力(T-AOC)作为第二种评价指标来确定虎龙杂交斑饲料VE的最适水平。

3.2 饲料维生素E 含量对虎龙杂交斑体组成的影响

VE作为动物体内重要的脂溶性抗氧化物质，可以改善肉质，增加风味，减缓脂肪酸分解[28]。在施氏鲟(Acipenserschrendkii)[29]和眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)[30]中，缺乏VE会导致肌肉营养不良和蛋白质含量下降。本实验中也得到了同样的结果，即随饲料中VE水平增加，肌肉粗蛋白含量呈现先上升后下降的趋势，表明饲料VE水平会影响虎龙杂交斑肌肉蛋白沉积。有研究认为，VE不足导致的肌肉蛋白沉积的下降主要是由于其蛋白质分解增强，且这一变化和胰岛素降低及皮质醇升高紧密相关[31]。胰岛素能刺激靶细胞的葡萄糖氧化以及糖原、ATP 脂肪、蛋白质的合成，并同时抑制蛋白质的分解[32]。

本实验发现，VE缺乏会使虎龙杂交斑肝脏s6k1 基因表达显著降低，这可能也是由于VE缺乏引起的胰岛素降低，进而造成s6k1 基因未被诱导表达，最终影响蛋白质的合成。但是作为蛋白质合成途径中的另一个关键因子tor，其在虎龙杂交斑肝脏中的表达并未受到饲料VE水平的影响，一般来说，s6k1 作为受mTOR 调控的下游基因，s6k1 的表达受tor的调控，tor的表达会上调s6k1的表达[33-34]，而本实验中未得到该结果。肌肉脂肪随着饲料VE水平增加呈先升后降，116.8 mg/kg VE饲料组肌肉脂肪含量最少，类似的结果同样出现在施氏鲟[29]和花鲈(Lateolabraxjaponicus)[35]的研究中，脂肪含量的上升可能会在一定程度上增加脂质过氧化程度，从而导致鱼肉在保存过程中出现滴水损失增加和酸败[28]。上述结果证明，饲料中添加适量的VE可以增加肌肉蛋白含量，减少脂肪含量，能在一定程度上提高鱼肉品质。

3.3 饲料维生素E 含量对虎龙杂交斑肝脏、肌肉维生素E 含量的影响

组织中维生素E 含量是评价维生素E 需求量的重要指标。有实验表明饲料中添加110 mg/kg VE可以使大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼鱼、庸鲽(Hippoglossushippoglossus)和金头鲷 (Sparus aurata)肝脏VE含量显著增加[36]，周立斌等[35]对花鲈的研究同样发现肝组织内VE蓄积量是随着饲料中VE添加水平的升高而增加。本研究也得到类似的研究结果，即209.3 mg/kg VE组虎龙杂交斑肝脏VE含量显著高于4.1 mg/kg VE组，且肌肉VE含量随饲料VE水平增加而升高，这与在玛拉巴石斑鱼中报道的相似[11]。

本研究中，肌肉VE含量少于肝脏，这可能是由于肝脏是VE的主要代谢器官[37]，且肝脏脂肪含量比肌肉高，也可能是增加脂溶性VE沉积的原因。在吉富罗非鱼(OreochromisniloticusGIFT)[38]、大菱鲆[39]和胭脂鱼(Myxocyprinusasitius)[40]的研究中也有相似的结论。饲料VE水平升高会使虎龙杂交斑肌肉VE含量持续上升。VE在肌肉中的累积不仅能提高鱼肉品质，还可以缓解鲜肉失色、脂质氧化和异味形成[28]，摄食适宜水平VE饲料可有效延长水产动物肌肉的货架寿命[41]。

3.4 饲料维生素E 含量对抗氧化和免疫指标的影响

VE是水产饲料中一种常用的强效抗氧化剂，根据饲料脂肪水平的不同，VE的最适添加量也会发生变化。当饲料中VE水平为 61～115 mg/kg 时，可优化生长性能并最大限度地减少氧化应激[5,42]。T-AOC 的水平可以体现动物机体的总抗氧化能力，包括抗氧化酶系统和非酶促系统[43]。本实验中，57.1 mg/kg VE饲料组肝脏T-AOC 显著高于4.1 mg/kg VE饲料组。但随着饲料VE水平增加，肝脏T-AOC 呈下降趋势，与在胭脂鱼中观察到的现象一致[40]。这可能是由于摄入过多的VE导致其在体内不再起到抗氧化作用，反而会促进氧化[10,23]，或是由于过多的VE抑制了抗氧化酶的活性，从而导致肝脏T-AOC 下降[40]，但其机制尚不完全明确。

头肾作为鱼类重要的免疫及抗氧化器官，在遭受氧化损伤时，其正常功能会受到影响，有报道指出，可通过增加抗氧化酶的活性来减弱这种氧化损伤[44]，Nrf2-Keap1 信号通路已被证明是抗氧化应激最重要的内源性信号通路，可调控多种抗氧化酶基因的表达[45]。本实验结果显示，饲料VE水平对keap1 基因的表达有显著影响，即当饲料VE含量超过23.05 mg/kg 时，keap1 基因表达较之前有显著提升，这与在多鳞鱚(Sillagosihama)[46]中结果相似。keap1 是Keap1-Nrf2 信号通路的主调节器，可根据细胞内的氧化还原状态打开或者关闭Keap1-Nrf2 通路[47]。正常生理条件下，KEAP1与NRF2 在胞浆内结合，主导NRF2 的降解，使之维持在正常水平，抑制下游基因表达。当细胞受到刺激后，NRF2 脱离KEAP1 进入细胞核，启动下游基因表达，提高抗应激及抗氧化能力。在铜胁迫72 h 后，摄食40.7 mg/kg VE饲料实验鱼头肾nrf2 基因相对表达量显著高于摄食4.1、26.3和209.3 mg/kg VE饲料实验鱼，keap1 基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势。铜胁迫后建鲤(Cyprinuscarpiovar.Jian)脑细胞核中NRF2 增加，会诱导下游抗氧化元件(CuZn-SOD 等)的表达[48]，与本实验结果一致。说明在铜胁迫下，饲料中添加适量的VE可上调nrf2 基因表达，增加细胞的抗氧化应激能力。keap1 的表达会增加NRF2 的降解，避免了由于NRF2 持续积累导致的细胞凋亡和自由基损伤[49]。有研究证明氧化压力增加会导致欧洲鳗鲡细胞nrf2 和keap1 转录上调，在相同促氧化剂的作用下会造成相似的表达趋势[50]。上述结果表明，饲料中VE缺乏或过量都会抑制抗氧化基因的表达，当饲料中添加适量的VE可以有效提高虎龙杂交斑杂交的机体抗氧化能力。

免疫球蛋白(IgM)在先天免疫和适应性免疫中起着识别和清除潜在病原体的重要作用。本实验显示饲料VE含量在57.1 mg/kg 时虎龙杂交斑血清IgM 浓度显著高于4.1 mg/kg VE饲料组和209.3 mg/kg VE饲料组。有研究表明，饲料中添加适量VE增加了草鱼[51]鳃中的IgM 活性和多鳞鱚[47]肝脏IgM 活性，然而在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[52]中并未观察到相同情况。溶菌酶(LZM)是鱼类重要的非特异性免疫酶[53]，饲料中添加适量的VE会增加军曹鱼(Rachycentroncanadum)[54]、玛拉巴石斑鱼[5]和黄颡鱼[52]的LZM 活性。在本实验中，57.1 mg/kg VE饲料组虎龙杂交斑血清LZM 的浓度高于4.1 mg/kg VE饲料组，这说明当饲料中添加适量的VE时可增强虎龙杂交斑的非特异性免疫能力。VE可以促进免疫，这在本次铜胁迫实验中也得到了进一步验证。铜胁迫后，4.1 mg/kg VE饲料组存活率显著低于40.7、57.1 和116.8 mg/kg VE饲料组。尽管VE对非特异性免疫的作用机制尚不清楚，但据报道，VE可能与白细胞介素(IL)-2 一样影响基因表达[55]，调节包括核因子kB(NF-kB)信号传导在内的信号传递[56]，并可能通过细胞免疫反应间接影响体液免疫[57]。

4 结论

综上所述，在本实验条件下，以WG 和TAOC 为评价指标得出虎龙杂交斑饲料VE最适水平分别为62.92 mg/kg 饲料和86.25 mg/kg 饲料，饲料中添加适量的VE可提高虎龙杂交斑生长性能、抗氧化和免疫能力。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）