饲料脂肪酸碳链长度对团头鲂生长、肌纤维发育及肉质的影响

王 曦，肖 康，刘文斌，戴永军，郭慧星，汪茫茫，李向飞，张定东，蒋广震

(南京农业大学动物科技学院，江苏省水产营养重点实验室，江苏 南京 210095)

脂肪酸是鱼类重要的结构与能源物质，同时还承担了机体内重要的生物学作用与生理学调控[1]。根据碳链长度，可分为短链、中链和长链脂肪酸3 类[2]。丁酸是极具代表性的短链脂肪酸之一，对改善动物肠道微生物菌群及肠道组织结构具有重要意义[3]。辛酸在椰子油中含量丰富，是较为理想的能源物质[4]，在畜牧生产中常用作亲本培育，以提高亲代成活率。棕榈酸分布广泛，几乎在所有植物油和动物脂肪中均含有数量不等的组分，适量棕榈酸能起到调控血清胆固醇含量的作用[5]。迄今，不同脂肪酸类型对鱼类脂肪代谢和肠道菌群的影响已有广泛研究，然而脂肪酸碳链长度对鱼体肌纤维发育和肉质影响的研究仍较为缺乏[6]。

肌肉组织是鱼类的主要可食部分[7]，占胴体重的70%～80%。鱼肉品质包括质地特性和营养品质，直接与消费者的接受程度挂钩[8]。其中，鱼类肌纤维的生长特性直接影响鱼肉的质地特性。质地特性包括硬度、黏附性、弹性、咀嚼性等，是通过模拟感官特性评价鱼肉口感的重要加工品质指标[9]，由其内部成分及组织结构决定。同时，鱼肉的营养品质与饲料营养密切相关，通过饲料原料比例的调节或微量营养素的添加，可以针对性地调控鱼类肌纤维发育及营养组成[10]。研究表明，不同脂肪源饲料可以显著影响鱼体成分[11]，鱼肉中脂肪酸组成及含量与饲料脂肪酸组成紧密相关。

随着人们生活水平的提高和供给则改革的推进，消费者对水产品品质的关注日益重视。团头鲂(Megalobrama amblycephala)隶属鲤科(Cyprinidae)鲂属(Megalobrama)。因生长速率快、产肉率高、肉质风味好，被作为一种较高经济价值鱼类在长江中下游水体中广泛养殖[12]。为此，本实验旨在研究饲料脂肪酸类型对鱼体肌纤维生长发育的影响，并探究饲料脂肪酸通过沉积调控团头鲂肉质品质的分子机制。以期为养殖鱼类品质调控提供理论依据，也为鱼类肌肉品质的营养强化提供全新模式。

1 材料与方法

1.1 实验设计及饲料配方

实验参照任阳[13]的方法，设置对照、丁酸(C4H8O2,BA)、辛 酸(C8H16O2,OA)及棕榈酸(C16H32O2,PA) 4 组，每组饲料配方根据团头鲂基本营养需求设计为31%粗蛋白和6%粗脂肪，3个实验组饲料中分别以BA、OA 及PA 替代1.5%豆油，其余饲料成分均保持一致。各原料均由江苏省泰州市海普瑞饲料有限公司提供，经由充分粉碎、冷却、过80 目筛后遵从“先小后大”原则逐级混匀，参照表1 所示具体配方挤压制粒(粒径2 mm，长度8 mm)。常温风干，待完全干燥后密封贮藏于-20 ℃备用。实验饲料脂肪酸组成见表2。

表1 团头鲂饲料配方表(干物质)Tab.1 Formulation of the experimental diets of M. amblycephala (dry matter) %

表2 饲料脂肪酸组成分析Tab.2 Fatty acid composition of the experimental diets g/kg

1.2 实验动物及养殖条件

养殖全程在南京农业大学水产教学科研基地的开阔池塘中展开，确保模拟团头鲂正常的生态环境。实验用鱼均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供，取108 尾体质健康、规格相近的个体[平均初始体重(77.89±0.81) g]，随机分配于12 个尺寸为2 m×1 m×1 m (长×宽×高)的悬浮网箱。每组饲料设置3 个平行，每网箱9 尾。

历经2 周暂养，在此期间所有实验用鱼以商业饲料(无锡通威饲料集团有限公司)进行初始驯化，使其更好地适应饲养环境，同时培养其定时定点上浮采食的习惯。正式实验期间，以团头鲂自由采食达到饱腹状态为准，具体投饵量视天气、水温、进食情况等因素而定，一日3 次定时定点手动投喂(8:00,12:00,16:00)。养殖全程水体环境pH 值为7.4～7.6，溶解氧含量为5.0 mg/L，水温28～34 ℃，氨氮浓度低于0.2 mg/L。本实验所有操作严格遵守实验动物福利伦理和动物实验安全审查规范，并按照水产动物实验伦理审查委员会制定的规章制度执行。

1.3 样品采集

实验为期57 d。养殖结束，停饲24 h 后对各网箱中团头鲂尾数和总重量进行统计。每网箱随机选取3 尾体格相当的团头鲂，通过注射MS-222(100 mg/L,Sigma,美国)麻醉。解剖取内脏团称重，以便胴体率和脏体比指标的计算。紧接着刮去侧线上方鳞片且剥取鱼皮，采集背肌样品于液氮速冻，用于基因表达分析；另取3 块背肌组织，1块(0.5 cm×0.5 cm×2 cm)固定于4%多聚甲醛溶液用于组织形态分析，1 块(1 mm×2 mm×3 mm)固定于2.5%戊二醛溶液用于超微结构分析，1 块(1 cm3)立方体鲜样4 ℃保鲜用于24 h 内质构分析。

1.4 测定指标

生长指标 相关指标测定见以下公式。

特定生长率(SGR,%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100%

增重率(WGR,%)=(Wt-W0)/W0×100%

饲料系数(FCR)=摄食量/(Wt-W0)

平均日采食量(AFI,g/尾)=日总采食量/总条数

胴体率(DP,%)=(Wt-Wi)/W×100%

脏体比(VSI,%)=Wi/W×100%

式中，Wt代表终末体重(g)，W0代表初始体重(g)，Wi代表终末鱼体内脏团重(g)，W代表全鱼体重(g)，t代表实验天数(d)。

饲料成分测定 参照AOAC 方法[14]检测并分析了饲料常规成分。水分测定采用105 ℃烘干法；粗脂肪测定采用乙醚索式提取法；粗蛋白测定采用凯氏定氮法；粗灰分测定采用550 ℃灼烧法。

1.5 肌肉质构

引入一系列肌肉在变形、分解、流动等方面的物理特性对鱼肉口感、组织状态进行准确评估。参考Hixson 等[15]对肌肉品质测定参数的设定，将采集样品置于50 mm 铝板，通过质构仪(TA.XT Plus,Stable Micro Systems,英国)以5 mm/s 预测试速度、1 mm/L 测试速度和5 mm/s 后测试速度，肌肉厚度50%回弹，作用时长60 s 进行全质构分析。

1.6 肌肉成分及饲料含量分析

样品脂肪酸提取 分别称取饲料及肌肉样品1 g，采用氯仿-甲醇(2∶1，体积比)法提取样品油脂。通过NaOH 甲醇酯化法制备脂肪酸甲酯混合物，待分析检测。

标准曲线建立 正己烷稀释37 种脂肪酸甲酯化混标(10 mg/mL,Sigma,美国)为0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 mg/mL 5 个浓度梯度，通过气相色谱仪(8890 GC,Agilent Technologies Inc.,美国)测定各已知脂肪酸组分含量，拟合标准曲线。

样品脂肪酸含量测定 取样品200 μL 上机检测，通过统计色谱出峰面积计算每种脂肪酸的绝对含量。其中色谱柱(Agilent Technologies Inc.,USA)型号为HP-88 (100 m,0.25 mm ID,0.2 μm)，选择后进样口流路进样，设定采集方法后，SS 进样口、色谱柱#1、后检测器FID 温度分别为270、100 和280 ℃。

1.7 肌肉组织形态分析

将采样时固定于4%多聚甲醛的肌肉样品依次置入乙醇梯度脱水(75%、85%、95%、100%)处理。修整样品尺寸(3 mm×3 mm×5 mm)，通过二甲苯透明、石蜡浸透后，包埋成正方体蜡块。用切片机(Leica,德国)制成厚度为6 μm 的石蜡切片，经过苏木精和伊红(H.E)染色，最终树脂封片，实现对肌肉组织学结构的呈现。通过虚拟显微镜(Nikon,日本)观察，于200 倍摄像捕捉(Nikon,DS-U2,日本)成像拍摄。每张切片选取3个不同视野，利用Image Pro Plus 图像软件(media cybernetics,美国)统计分析肌纤维特性。

1.8 肌肉超微结构分析

采集样品经由2.5%戊二醛溶液24 h 固定处理，由磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3 次，置于1%锇酸中固定。历经乙醇梯度(50%、70%、80%、90%)脱水处理，通过丙酮浸透作用后完成包埋操作。最终制成厚度为70 nm 的超薄切片，经由铀和铅双染处理。电镜放大倍数为8 000 倍，借助ATM 摄像系统(HATICHA,日本)进行成像拍摄。每张切片选取3 个不同视野，每个视野读取3 次，利用Image Pro Plus 图像软件(media cybernetics,美国)统计并分析肌节长度(SL)。

1.9 基因表达

使用TRIzol 试剂(Invitrogen,美国)提取肌肉组织中总RNA，通过RQ1 RNase-free DNase(Promega,美国)消除提取过程中可能存在的基因组DNA 降解。使用ExScriptTMRT-PCR 试剂盒将RNA 反转录为cDNA。目的cDNA 采用SYBR 稀释扩增，使用Green Ⅱ荧光试剂盒(TaKaRa,日本)进行后续实时定量PCR 测定。以延伸系数1α(ef1α)作为目的基因转录水平相对量化参照[16]。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。参照Livak 等[17]的方法，运用2-ΔΔCt计算目的基因mRNA 的相对表达量。

表3 实时定量PCR 引物的核苷酸序列Tab.3 Nucleotide sequences of the primers for real-time quantitative PCR

1.10 数据分析

所有实验数据均由Kolmogorov-Smirnov 和Levene 检验评价正态性和同质性。通过SPSS 16.0 软件(SPSS,美国)进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析。数据的组间差异由Tukey 氏多程检验确定，显著性水平为P<0.05。所有实验结果均采用3 重复(n=3)的平均值±标准误(mean±SE)表示。

2 结果

2.1 生长性能

与对照组相比，饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加对团头鲂终末体重、特定生长率、增重率、饲料系数、平均日采食量、胴体率及脏体比指标均无显著影响(P>0.05) (表4)。

表4 饲料不同碳链长度脂肪酸对团头鲂生长的影响Tab.4 Effects of dietary fatty acids with different carbon-chain lengths on the growth of M. amblycephala

2.2 肌肉品质测定

PA 组团头鲂肌肉硬度较对照组显著升高(P<0.05)；与对照组相比，BA 和OA 组也呈上升趋势，尽管这种差异并不显著(P>0.05)。对照组肌肉黏附性显著高于BA、OA 和PA 组(P<0.05)。咀嚼性、胶黏性、内聚性、弹性及回复性各物理指标检测结果显示，各组团头鲂肌肉均无显著差异(P>0.05) (表5)。

表5 饲喂实验饲料对团头鲂肌肉质构的影响Tab.5 Effects of experimental diets on white muscle texture of M. amblycephala

2.3 肌肉脂肪酸组成

由于饲料中不同类型脂肪酸的添加，使得团头鲂肌肉中脂肪酸含量存在一定的差异性(表6)。与对照组相比，PA 组团头鲂肌肉C16:0、C18:0及C20:3n3 含量显著升高(P<0.05)。与此同时，BA、OA 及PA 组C16:1 含量显著高于对照组(P<0.05)，C18:1n9 含量也呈现出相似趋势。OA 及PA 组C20:2 含量显著高于对照组及BA 组(P<0.05)，C22:6n3 含量最高值出现在PA 组，且显著高于对照组及BA 组(P<0.05)。各实验组团头鲂肌肉中其余脂肪酸含量间均无显著差异(P>0.05)。

表6 饲喂实验饲料对团头鲂肌肉脂肪酸组成的影响Tab.6 Effects of experimental diets on muscle fatty acid composition of M. amblycephala g/kg

2.4 肌肉组织形态分析

图版Ⅰ为饲喂实验饲料团头鲂肌肉横截面，其中肌纤维横截面呈不规则多边形，白色间质为肌内膜，是包裹在每条肌纤维外的疏松结缔组织。相较于对照组，饲料中添加不同碳链长度脂肪酸的3 组肌纤维数目明显增多，肌纤维间空隙减少，肌纤维平均直径减小(图版Ⅰ)。从具体数据统计结果来看(表7)，PA 组团头鲂肌纤维平均横截面积显著低于对照、BA 和OA 组(P<0.05)。BA、OA 和PA 组肌纤维数量、密度较对照组显著增加(P<0.05)，且PA 组显著高于其余两种脂肪酸添加组(P<0.05)。与此同时，按照肌纤维直径的比例划分，发现随着饲料添加的脂肪酸碳链长度的增加，较小直径(<20 μm)肌纤维出现比例显著增加(P<0.05)；较大直径(>50 μm)肌纤维的最高比例出现在对照组，且显著高于其他3 个脂肪酸添加组(P<0.05)。此外，BA 和OA 组肌纤维直径分布在20～50 μm 的比例显著高于其他两组(P<0.05)。

图版Ⅰ 饲喂实验饲料团头鲂肌肉横截面1～4 分别为对照组、丁酸组(BA)、辛酸组(OA)及棕榈酸组(PA)，图2 同，虚拟显微镜放大倍数为200 倍。Plate Ⅰ Transversal sections of white muscle in M. amblycephala fed experimental diets1-4.control group,butyric acid group (BA),octanoic acid group (OA),and palmitic acid group (PA),the same as Fig.2.The magnification of the virtual microscope is 200 times.

表7 饲喂实验饲料团头鲂肌纤维结构及肌节长度Tab.7 Muscle cellularity and sarcomere length of M. amblycephala fed experimental diets

2.5 肌肉超微结构分析

两条相邻Z 线之间的一段肌原纤维称为肌节，每个肌节由1/2 明带+暗带+1/2 明带组成，是骨骼肌纤维结构与功能的基本单位。图版Ⅱ中肌节长度(SL)由双向箭头间的距离标出。与对照组相比，BA、OA 和PA 组SL 长度显著增加(P<0.05)，且随着脂肪酸碳链长度的增加，SL 长度也呈现出同步上升趋势(P<0.05) (表7)。

图版Ⅱ 饲喂实验饲料团头鲂肌肉透射电镜双向箭头表示肌节长度，单向箭头所指的是Z 线，电子显微镜放大倍数为8 000 倍。Plate Ⅱ Transmission electron microscope of white muscle in M. amblycephala fed experimental dietsThe black distance between the two-way arrows indicates the sarcomere lengths (SL),the black line pointed by the one-way arrow is the Z disk.The magnification of the electron microscope is 8 000 times.

2.6 肌肉中的基因表达

饲喂不同脂肪酸类型饲料对团头鲂肌肉中ampkα1 基因表达量无显著影响(P>0.05) (图1-a)。ampkα2 基因mRNA 表达量受BA 显著上调(P<0.05)，与此同时，OA 和PA 组也较对照组呈现升高趋势(P>0.05) (图1-b)。BA 组sirt1 基因的表达量显著高于其他实验组(P<0.05)，然而其表达不受饲料中OA 和PA 添加作用的影响(图1-c)。不同碳链长度脂肪酸添加组团头鲂肌肉中mstnb基因mRNA 表达量均有不同程度的降低，其中BA组显著低于对照组(P<0.05)，而在mstna基因上没有观察到类似结果(P>0.05) (图1-d～e)。此外，肌肉中myod、myog和mrf4 基因mRNA 表达量不受饲料中不同碳链长度脂肪酸添加的影响(P>0.05)(图1-f～h)，而OA 组myf5 表达量显著高于对照组(P<0.05) (图1-i)。饲料中BA、OA 和PA 显著上调了肌肉中camk基因的表达量(P<0.05)，所有实验组鱼肉中can基因mRNA 表达量无显著差异(P>0.05) (图1-j～k)。

(图1 Fig.1)

3 讨论

3.1 饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加对团头鲂生长的影响

在本研究中，3 种不同碳链长度的脂肪酸添加对团头鲂的生长均无显著影响。晏显芳等[18]发现，丁酸钠的浓度或剂型的改变对草鱼(Ctenopharyngodon idella)幼鱼生长均无显著影响，这些与本研究结果一致。然而，Robles 等[19]对金头鲷(Sparus aurata)的研究表明，丁酸钠可显著提升其平均增重。另一项研究显示，饲料中添加0.15%的丁酸钠在显著提升大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼增重率的同时，也提升了表观消化率[20]。导致这一不同结果的可能原因：①丁酸钠对鱼类生长的影响具有剂量效应，即饲料中丁酸钠添加剂量的过多或过少均无法引起生长的响应[21]。②丁酸钠主要通过促进肠道发育和改善肠道健康状况而影响生长，但这种促进作用因动物品种、日龄、肠道状态而异[22]。由于碳链较长链脂肪酸短，因此中链脂肪酸具有更好的消化吸收特性，在机体内主要履行供能作用[23]。目前，关于中链脂肪酸对动物生产性能的影响结果仍存在争议，有实验表明了其对动物生产性能的积极作用，但也有降低增重的反例出现[24]。联系到以辛酸为代表的中链脂肪酸在机体内的作用机制，其可以通过采食量、肠道免疫和Ghrelin 分泌等多种途径影响动物的生长，因此猜测辛酸的添加剂量可能是关键性因素。棕榈酸常通过内生途径，在碳链延长酶和去饱和酶的协同作用下生成长链多不饱和脂肪酸[25]，并未发现棕榈酸添加对斑马鱼(Danio rerio)雌鱼体重与体长的显著影响[3]。

3.2 饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加对团头鲂肌肉脂肪酸组成的影响

饲料脂肪酸是影响养殖鱼类肉质的重要因素。众所周知，脂肪酸在肌肉中的沉积受饲料脂肪酸类型的直接影响[26-27]。通过饲料中脂肪酸种类的调节，可以改进鱼肉营养组成，实现对肉质的调控。本研究中，团头鲂肌肉并未检测出十二碳以下脂肪酸含量，原因可能是短、中链脂肪酸对脂质代谢的调节增强了机体脂肪酸的利用；也可能是其链长较短，在机体中更容易被消化水解造成的[28]，截至目前，关于丁酸和辛酸对鱼类肌肉成分的作用尚未见报道，具体原因仍有待进一步研究。棕榈酸可以显著提升团头鲂肌肉中的C16:0含量，李新等[29]在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)上的相关研究也得到了类似结果。然而，Mata-Sotres 等[30]发现，幼年加州黄尾鰤(Seriola lalandi)饲料中脂肪酸类型均按比例沉积，除SFA(主要是16:0)以外，肌肉组织在很大程度上反映了饲料的脂肪酸组成。这与实验结果不一致，其原因可能与实验动物的品种和生理阶段等有关。通常认为，鱼类具有内源性合成并利用C16:0 和C18:0 的能力，并且在去饱和酶Δ9 的催化下可进一步合成C16:1 及C18:1n9 等脂肪酸类型[31]。在本研究中，添加丁酸、辛酸、棕榈酸显著提升了团头鲂肌肉中C16:1 和C18:1n9 含量，这可能是不同碳链长度脂肪酸的补充通过机体内源性代谢的结果。鱼体脂肪酸组成取决于饲料摄入和内源性代谢的共同作用，同时伴随消化与吸收，最终以另一种脂肪酸或脂肪酸衍生物形式积累[29]。值得注意的是，肌肉中C20:2、C20:3n3 及C22:6n3的沉积量也在棕榈酸作用下显著提升。饲料中饱和脂肪酸的添加增加了鱼肉中不饱和脂肪酸的总量，与此同时，C22:6n3 (DHA)还是对人体有益的脂肪酸类型，因此用不同碳链长度脂肪酸饲喂可以有效调控鱼肉脂肪酸组成和含量，满足人类对养殖鱼类的品质需求。目前，不同碳链长度脂肪酸在动物生产中的应用尚不广泛，不同碳链长度脂肪酸在鱼类肌肉中的沉积作用及提升肌肉营养品质的相关机制仍有待进一步探究。

3.3 饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加对团头鲂肌肉特性的影响

鱼类骨骼肌是人类食物的重要蛋白来源[32]。然而，鱼肉品质的评估并非一项简单工作。鱼肉品质由内在因素(质地、化学组成、颜色和脂肪含量等)决定[33]，其中质地直接影响消费者对鱼肉的感官特性[8]。Choi 等[34]发现，鱼肉质地与肌纤维特性密切相关，因此分析肌纤维密度、横截面积及直径变化等是探究肌纤维发育的重要方法[35]。肌纤维密度包含了肌纤维数量和肌纤维大小等信息，与硬度和咀嚼性特征呈正相关；平均肌纤维横截面积/直径与硬度呈负相关性，即较小平均肌纤维横截面积/直径的鱼肉具有较大的感官硬度[36]。本研究中，饲料中棕榈酸的添加显著提升了鱼肉硬度，这可能是棕榈酸通过提升团头鲂肌纤维数量和密度、降低平均肌纤维横截面积的共同作用，实现了对鱼肉质地的改善。Johnston 等[37]在对比大西洋鲑(Salmo salar)两个不同品系时发现，高肌纤维密度的鱼肉具有更好的质地特性。Hurling 等[38]认为平均肌纤维横截面积越小，鱼肉越容易获得较高感官硬度，这些都与本实验结果一致。与此同时，根据脊椎动物骨骼肌生长发育特点，常以直径<20 μm 肌纤维的比例决定肌肉的生长状态[35]。本研究中，饲料不同碳链长度脂肪酸的添加显著提升了直径<20 μm 肌纤维的比例，代表肌纤维处于较为活跃的生长模式[39]。与哺乳动物不同，鱼类骨骼肌可以同时实现肌纤维的肥大和增生[40]。因此，不同碳链长度脂肪酸显著促进了团头鲂肌肉的增殖，展现了肌肉对肌纤维较强的募集作用。

肌节是肌纤维收缩的基本功能单位。有研究表明，肌节长度与肌肉嫩度呈正相关，即肌节长度越长，肌肉品质越嫩。Herring 等[41]对比了约束和自由状态下牛肉的肌节长度后发现，肌节越长肉片嫩度也越高。曾勇庆等[42]在探究莱芜猪不同部位肌肉超微结构与肉质的关系时也得到了相同结论。这与在鸟类[43]和其他哺乳类动物[44]上的研究结果一致。本研究中，肌节长度在丁酸、辛酸及棕榈酸的作用下显著增加，鱼肉也更加柔嫩，可能的解释是脂肪酸促进了肌节高度有序的装配过程，从而使肌节长度变长；也有可能是脂肪酸提升了细胞内Ca2+浓度，加速了肌钙蛋白和Ca2+结合的效率。值得注意的是，与追求哺乳动物肉片的柔嫩质地相反，消费者在选择鱼肉制品时总是更倾向于鱼肉的紧凑质地[45]。因此，不同碳链长度脂肪酸对团头鲂鱼肉品质的改善是两方面的，既包括硬度的提升，又包括嫩度的改善。不同碳链长度脂肪酸对肌纤维发育的综合影响对改善鱼肉质地有积极作用，但是具体的机制仍有待进一步探究。

3.4 饲料中不同脂肪酸添加对团头鲂肌纤维发育相关基因mRNA 的影响

肌源性调节因子(MRFs)包括myod、myog、mrf4 和myf5[46]，自胚胎阶段开始协同调控骨骼肌的生长和发育过程[47]，与鱼肉品质密切相关。然而家族各成员的时空表达具有特异性，myod和myf5 在肌肉发育早期扮演生肌决定因子的角色[48]；后期由myog和mrf4 共同承担成肌细胞的融合与分化功能[49]。尽管如此，决定MRFs 基因活化与表达与否并非易事，除了个体发育、细胞生长状态等内部因素的作用外，也可能受营养水平等外界因素调控[50]。Huang 等[51]发现高脂饲料通过上调团头鲂肌肉中myog、mrf4 和myf5 表达量促进团头鲂肌纤维发育。黄河鲤(Cyprinus carpio)饲料中n-3/n-6 脂肪酸比例的变化直接影响肌肉中的myod表达量[52]。本研究中，辛酸通过调控转录因子myf5 参与团头鲂肌纤维发育的增殖过程，而myod的相对表达量没有受到不同碳链长度脂肪酸的影响，可能是因为与myf5 二者在功能上存在重叠区域，可以协同启动鱼类肌源细胞的分化功能[53]。当myod表达阻遏时，myf5 出现了代偿性表达，因此并不影响团头鲂肌肉的发育状况[54]。与此同时，饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加提高了myog和mrf4 基因的相对表达量，尽管差异并不显著，这可能与团头鲂肌纤维发育尚未到达成熟期，甚至大部分仍处于成肌细胞增殖阶段有关。当肌纤维发育处于分化/融合期时，myf5 与myod尚且具有互补能力，同时myog和mrf4 的高表达阶段还未达到，具体肌纤维发育所处阶段仍需进一步探讨。此外，肌肉生长抑制素(mstn)是重要的负调节因子，起到抑制超弹性骨骼肌的生长作用。目前利用多技术手段证实，mstn的降调在斑马鱼发育过程中对肌纤维具有增生或肥大的作用[55]。本研究中，丁酸组mstna基因表达降低，这与该组肌纤维密度和较小直径(<20 μm)肌纤维比例的增加结果相符。以上这些结果都表明了不同碳链长度脂肪酸在肌纤维持续补充和肥大过程中的促进作用。

3.5 饲料中不同脂肪酸添加对能量感知通路相关AMPK/Ca2+基因mRNA 的影响

AMP 依赖的蛋白激酶(AMPK)作为机体的能量传感器，具有在细胞水平平衡能量进出的重要功能。通过运动或能量等外部条件的激活作用，AMPK 获得磷酸化实现对下游靶向通路的调节，其中就包括骨骼肌组织[56]。Sirt1 是AMPK 信号通路中重要的下游受体，已有研究表明，Sirt1 对营养的可用性和能量的增减均能做出敏捷反应[57-58]。Wang 等[59]发现DHA 可以通过AMPK/Sirt1 途径调节MRFs 的表达进而影响肌纤维的增殖与分化；暴露在高脂环境的团头鲂原代肝细胞中AMPK 及Sirt1 蛋白水平显著增加[51]。这也就意味着，脂肪酸的摄入可以通过AMPK 上调细胞中NAD+的离子水平，进一步激活下游沉默信息调节器(Sirt1)[60]。CAM 激酶家族成员在骨骼肌功能中起重要作用，更有多功能激酶可以实现肌肉塑形[61]。钙调素依赖性蛋白激酶(CAMK)和钙调神经磷酸酶(CaN)通过动作电位灵敏感知细胞中的Ca2+浓度变化[62]，与此同时，这种变化使得CAMK 激活CaN 进而显著促进调控肌肉发育基因的表达[61]。AMPK 和Ca2+依赖的信号通路是影响哺乳动物肌纤维类型转化的重要途径[63]。本研究中，饲料丁酸的添加提升了ampkα2 和sirt1 基因mRNA 的表达量，暗示其激活了AMPK/Sirt1 通路；同时不同碳链长度脂肪酸的添加显著上调了camk基因的相对表达量，Ca2+依赖的信号通路也呈现激活状态。总之，饲料中不同碳链长度脂肪酸的添加促进了团头鲂肌肉的增生和肥大过程，这一调控机制可能通过AMPK 及Ca2+依赖的信号通路共同实现。目前，AMPK 及Ca2+依赖的信号通路在鱼类肌纤维发育上的研究较少，不同类型脂肪酸对鱼类肌纤维发育机制的影响仍有待补充完善。

4 结论

综上所述，饲料中丁酸、辛酸、棕榈酸的添加可能通过AMPK 和Ca2+依赖的信号通路提升团头鲂肌肉质地、肌纤维密度以及较小直径肌纤维(<20 μm)比例，从而实现对团头鲂肌肉品质的改善。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）