基于聚偏氟乙烯-三氟乙烯的复合压电纳米粒子用于脑胶质瘤细胞的精准成像与靶向治疗

陈治光 张 巍 何 文

(首都医科大学附属北京天坛医院超声科,北京 100070)

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,约占颅内恶性肿瘤的80%,年发病率约为4.63例/10万人,自1990年至2016年,其发病率增加了17.3%[1]。脑胶质瘤具有高致残率和高致死率的临床特点,5年生存率约为5%,给家庭及社会带来了极大的经济和医疗负担[2-3]。随着相关研究的不断深入,关于脑胶质瘤的治疗逐渐精准化、个体化。目前主要的治疗方式是手术切除结合放射治疗和化学治疗,但由于血脑脊液屏障、血肿瘤屏障、肿瘤的多形性以及肿瘤的多药耐药性,现有方法很难大幅改善脑胶质瘤患者的平均生存率[4-5]。声-压电动力治疗作为一种新颖的治疗方式,在体外和体内实验研究中具有显著的抗肿瘤效果[6]。在本文研究中,笔者基于压电材料的正压电效应,拟通过基于偏氟乙烯(vinylidene fluoride, VDF)和三氟乙烯(trifluoroethylene, TrFE)的共聚物 [poly (VDF-TrFE), P(VDF-TrFE)]有机压电材料构建一种复合压电纳米粒子,通过外界超声刺激使其具备一定的电荷用于脑胶质瘤的治疗。

1 材料与方法

1.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子的合成

取10 mg P(VDF-TrFE)(30∶70 质量比)粉末均匀铺平至玻璃容器中,将其置于120℃烘箱内恒温加热10 min,然后以1℃/min降至室温,即获得重结晶的P(VDF-TrFE)粉末。将上述粉末溶于2 mL 丙酮,制成浓度为5 mg/mL的P(VDF-TrFE)溶液。

取10 mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-四氮杂环配体 [1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(ethylene glycol)-tetranitroheterocyclic ligand, DSPE-PEG-DOTA] 溶于三氯甲烷,取10 mg醋酸钆溶于乙酸,将两种溶液缓慢汇合为反应液,通过pH标准液调节反应液pH为7.4,充分混匀,置于旋转混合器于室温下搅拌过夜,通过旋转蒸发除去有机溶剂,将沉淀重悬于1 mL双蒸水,过滤除去未溶解沉淀即为DSPE-PEG-DOTA-钆造影剂 (DSPE-PEG-DOTA-Gd)。

按摩尔比为1∶1的DSPE-PEG-马来酰亚胺脂 (DSPE-PEG-maleimide, DSPE-PEG-Mal) 和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸合成肽 (Arg-Gly-Asp, RGD) 溶于500 μL的二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO),置于37℃恒温箱搅拌过夜,通过点击化学反应即获得DSPE-PEG-Mal-RGD。

将DSPE-PEG-DOTA-Gd和P(VDF-TrFE)按一定摩尔比溶于丙酮,然后加入一定量的DSPE-PEG-Mal-RGD,剧烈搅拌,并使用尖端超声仪分散10 min,将上述混合溶液置于旋转混合器搅拌过夜(15 r/min,37℃);通过旋转蒸发除去大部分有机溶剂,将残余溶液进行离心(2 500g,4 ℃,30 min)得到沉淀,将沉淀溶于超纯水并以相同离心参数洗涤3次,即获得P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD。

1.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子的表征

通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)对粒子粒径和ζ电位进行表征,即取一定量浓度为2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液用双蒸水稀释为200 μg/mL的待测溶液,充分混匀后置于样品池中,分别设置检测目标为粒子粒径和ζ电位,每个样品以6/次循环检测。

通过扫描电子显微镜对其形貌进行表征,即取一定量浓度为2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液稀释后滴于1.0 cm × 1.0 cm的硅片,自然风干,通过离子溅射仪镀金20 s后进行拍照。

通过X-线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)对其成分进行表征,即取一定量浓度为2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液滴于锡纸上,待样品自然风干后进行XPS分析。

通过压电响应力显微镜对其压电性能进行表征,取一定量浓度为2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液,通过旋涂的方法将其固定于2 cm × 2 cm的导电硅片上,在压电响应力测试模式下随机选择1 μm × 1 μm的区域进行压电系数、压电势能的表征。

通过小动物磁共振成像仪对其磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI) 能力进行表征,简言之,通过计算Gd离子浓度,将其制为Gd浓度为0.1、0.2、0.4及0.6 mmol/L的溶液。

1.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子细胞生物相容性检测

通过U87-MG、A172、U251脑胶质瘤细胞系评估P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的生物相容性,简单地说,将对数生长期的细胞按4×104/孔浓度接种于96孔板中,细胞贴壁后将P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD按0、25、50、75、100、200、300、400及500 mg/mL的浓度与细胞共孵24 h,随后进行 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]实验评估细胞活性。

1.4 超声刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对胶质瘤细胞的杀伤作用

为评估单独超声刺激后细胞活性变化情况,设置超声参数为频率1 MHz、声强1 W/cm2、占空比20%,取对数生长期的细胞按4×104/孔浓度接种于96孔板中,细胞贴壁后,分别给予超声刺激0、10、20、30、40及50 min,于刺激后24 h进行MTT实验评估超声对细胞的杀伤作用。

将纳米粒子按不同浓度与细胞共孵24 h后,给予有效超声刺激,于治疗后24 h行MTT实验评估超声联合纳米粒子对细胞的治疗作用。

1.5 超声刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对胶质瘤细胞凋亡、迁移和侵袭能力的影响

通过流式细胞术定量分析各个实验组发生早期、晚期细胞凋亡的情况;通过伤口愈合实验评估在相应处理后48 h细胞的迁移能力;通过细胞侵袭实验(Transwell assay) 评估48 h时细胞穿过Transwell小室的数目。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的粒径和电位

根据DLS表征可知P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子粒径为(226.8±2.13)nm(图1A),而ζ电位为-27.6 mV(图1B)。P(VDF-TrFE)作为该复合压电纳米粒子合成的原材料,粒子粒径约为(377.7±5.2)nm(图1A),ζ电位为-18.7 mV (图1B)。将P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶于不同的溶剂进行粒径表征,在粒子合成后的第1天、第3天、第7天、第14天和第21天分别进行了DLS检测,发现该粒子在DMEM中粒径最稳定,且保持在160 nm左右,且该粒子的ζ电位只有当溶剂是双蒸水时才能测出。

图1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD及P(VDF-TrFE)粒径及成分表征Fig.1 Characterization of particle size and composition of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD and P(VDF-TrFE)

2.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的成分分析

通过XPS对P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD元素组成进行分析,由于原材料P(VDF-TrFE)中只含有C、H和F元素,以DSPE-PEG-DOTA-Gd和DSPE-PEG-Mal-RGD进行亲水性改善,因此,XPS分析结果在C和F元素的基础上出现了P元素、Gd元素、N元素、O元素以及Na元素(图1D)。对P(VDF-TrFE)和P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的C元素单独分析,发现P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素第二峰的结合能有明显提高(图1E)。通过多峰拟合可以发现P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素各价位结合能趋于平稳(图1F)。

2.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的形貌和压电性能

通过压电响应力显微镜对P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的压电性能进行表征,在外加电场±10 V的作用下,P(VDF-TrFE)和重塑后的P(VDF-TrFE)压电材料的表面电势发生了改变,材料表面经过高温重塑后更为光滑(图2A),而未重塑的材料表面相对不光平整(图 2B)。图2C 是P(VDF-TrFE)的压电响应振幅图,可以观察到压电材料呈现出典型的蝴蝶形曲线,重塑后的粒子表面电势明显增加,约为4.2 mV,而没有经过高温重塑的P(VDF-TrFE)材料表面电势较低,仅约1.1 mV。图 2D是压电响应相位图,说明材料在外加电压的情况下发生了自发极化,因此被认为具有良好的铁电特性。

P(VDF-TrFE)压电纳米粒子在扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)下呈现为大小相对均一的球形结构(图2E),经过晶型重塑和亲水性改善后粒子间相对分散(图2F)。以水作为对照,对P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子的MRI成像能力进行检测,当Gd离子浓度为0.4 mmol/L时即有明显的成像效能,在0.6 mmol/L时成像性能更为明显(图2G)。

2.4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对细胞的杀伤作用

本文研究设定的超声声强为1 W/cm2,频率为1 MHz,占空比为20%,为明确超声作用时间对细胞的杀伤作用,分别对脑胶质瘤细胞U87-MG、A172以及U251细胞系进行了0 min到50 min的超声刺激。发现对于U87-MG和U251细胞系,在超声作用30 min及以上时,细胞活性明显减低且与对照组差异有统计学意义(图3A),而A172细胞系在超声作用20 min时细胞活性即有显著降低(P<0.05)(图3A)。通过复合压电纳米粒子进入细胞时间节点的实验,发现在24 h时纳米粒子与溶酶体发生了明显的共定位,即说明粒子已经进入细胞(图3B),通过流式定量分析可知,纳米粒子进入细胞的量随时间延长而增多(图3C)。

图3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对细胞活性的影响Fig.3 Effect of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell viability

选择纳米粒子与细胞共同孵育24 h后再给予处理,发现不同浓度的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对胶质瘤细胞的杀伤作用效果不同。P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对U-251和U87-MG细胞系没有明显的毒性作用,而当粒子浓度为100 μg/mL时即对A172细胞表现出明显的毒性作用(P<0.01)(图3D)。在超声作用下时,U87-MG和A172细胞系活性明显受损,就U87-MG细胞系而言,当粒子浓度为300 μg/mL时,细胞活性就显著低于对照组(P<0.001)(图3E)。而在超声作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子能产生更多的活性氧,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)(图3F和图3G)。

2.5 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对细胞增殖的影响

流式图中Q1、Q2、Q3、Q4分别对应了坏死、晚期凋亡、早期凋亡和正常健康细胞群体(图4A)。对照组约有0.18%的细胞群发生了坏死,而约99.8%为健康细胞群;在单独纳米粒子组(健康细胞93.5%,早期凋亡细胞5.05%,晚期凋亡细胞1.23%)和单独超声组(健康细胞87.1%,早期凋亡细胞10.8%,晚期凋亡细胞1.54%)中观察到了轻微的凋亡。然而,在超声联合作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD能引起31.1%的细胞发生早期凋亡, 9.26%的细胞发生晚期凋亡,而健康细胞仅58.2%,与对照组细胞凋亡情况比较差异有统计学意义(χ2=53.165,P<0.001)(图4B)。

图4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD对细胞凋亡、侵袭和迁移的影响Fig.4 Effects of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell apoptosis, invasion, and migration

伤口愈合实验表明在24 h时,对照组愈合已超过55%,单独超声组和单独纳米粒子组愈合分别约为36.19%和41.35%,而超声+纳米粒子组愈合仅约15.41%,明显低于其他各组(P<0.01);在24 h时,对照组细胞通过Transwell细胞数约为190个,同等时间内,单独超声组和纳米粒子组细胞通过Transwell细胞数约为150个,占对照组的78.95%,而在超声联合纳米粒子组细胞通过Transwell细胞数仅约为51个,约为对照组的26.84%(P<0.01)。基于此,本研究证实了P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD在超声激发后能够引起胶质瘤细胞凋亡,同时能够有效抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

3 讨论

压电材料是指在受到机械应力作用后在材料表面发生电荷输出的材料,且电荷输出量与应力大小成正比,这种效应又称为压电效应[7]。压电效应的本质是机械能与电能之间的转化,当机械能作用于压电材料产生电能时称为正压电效应,压电纳米材料可以克服当前电刺激治疗的局限性,通过外部机械刺激激活(如超声波)产生内部电场,在神经调节、细胞增殖中有着重要的作用[8]。压电纳米材料分为有机材料和无机材料,目前研究最多的是无机材料,如钛酸钡 (BaTiO3)等,通过超声激发触发的声-压电动力治疗导致肿瘤发生可逆性电穿孔、产生的单线态氧等进一步杀伤肿瘤细胞[9-11]。与传统的氧化锌(ZnO)、BaTiO3、铌酸锂等无机压电材料相比,P(VDF-TrFE)有着优异的柔韧性、生物相容性、更高的残余极化和机电耦合因子,因此被广泛应用于声学传感器[12]、电致伸缩装置[13]、压电传感器[14]等领域中。因其压电性能相对较弱,目前应用最为广泛的是将P(VDF-TrFE)制备为薄膜在体外进行相关研究[15-18]。P(VDF-TrFE)亲水性差[19],目前将P(VDF-TrFE)制成纳米粒子用于体内的研究尚少,Pucci 等[20]将抗肿瘤治疗药物Nutlin-3搭载于功能化后的P(VDF-TrFE)纳米粒子,在外部超声的激发下产生了优异的压电电势并激活细胞凋亡和抗增殖途径,与Nutlin-3联合引起的电化学效应对胶质瘤细胞产生了有效的杀伤作用,这项研究开辟了P(VDF-TrFE) 材料应用领域的新方向,即将其以纳米粒子的形式直接作用于细胞,有望实现通过压电效应刺激组织生长或杀伤靶细胞。

P(VDF-TrFE)粒子有着多种晶型,在常温下以α晶型为主,然而β晶型含量越多其压电性能越好。通过加热、拉伸或施加强电场等方式均可使α晶型转变为β晶型,即晶型重塑。有学者[21-22]通过对P(VDF-TrFE)薄膜进行热退火处理获得了更好的结晶相,即获得了更多的β晶型从而增加了材料的极性进而获得了更好的压电性。同时,研究[19,23]发现通过溶液共混法或表面涂层法可对PVDF材料进行改性。因此,在本文研究中,笔者通过热退火处理对P(VDF-TrFE)粒子的晶型进行重塑,以DSPE-PEG-Mal-RGD和DSPE-PEG-DOTA-Gd改善其亲水性。

在本文研究中,笔者基于P(VDF-TrFE)压电纳米材料制备了兼具MRI成像功能与靶向治疗脑胶质瘤细胞的复合压电纳米粒子,该粒子有着稳定的粒径,尤其是在DMEM溶液中,这可能是由于DMEM中含有大量的氨基酸(如苯丙氨酸、赖氨酸)和葡萄糖,它们可吸附于纳米材料表面形成一层吸附分子,避免了纳米粒子间的互相聚集,从而增加了粒子的稳定性[24-26]。而该粒子的ζ电位只有在双蒸水中能够测出,0.9%NaCl、PBS和DMEM溶剂中有着大量的Na+、K+等,电荷的排斥作用会导致纳米颗粒的带电量变小,使ζ电位达到等电点,从而不稳定,以至于不能获得ζ电位图[27-28]。重要的是,该粒子在超声作用下可以产生一定量的活性氧,从而诱导细胞发生凋亡,并且影响细胞的侵袭和迁移能力。其作用机制可能是因为电刺激通过影响K+通道抑制了细胞分裂,并在细胞分裂过程中干扰细胞骨架的形成,尤其在有丝分裂过程中干扰纺锤体的形成[29-31]。同时,低强度电刺激能够在不使用任何药物的情况下影响细胞增殖,而且可以通过影响多耐药蛋白的质膜异位来降低肿瘤细胞的耐药性[32]。

总之,本文研究构建的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD复合压电纳米粒子可以作为一种MRI显像剂,在精准、个体化治疗中可实现分子影像的实时引导,同时该纳米粒子作为一种声敏剂可用于癌细胞的声动力治疗,在鸡尾酒疗法中具有潜在应用价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明陈治光:设计研究方案,数据分析,撰写论文;张巍、何文:提出研究思路,总体把关,审定论文。