产前应激对情绪相关脑区c-Fos神经元激活的影响

李志恒 于 鑫 袁 莹 徐志卿,*

(1.首都医科大学基础医学院病理学系,北京 100069; 2.首都医科大学基础医学院神经生物学系,北京 100069)

产前应激(prenatal stress,PS)即母体妊娠期间受到环境因素、社会因素等各种负性压力[1],将对人类与啮齿类动物的子代产生不利影响,如损伤情绪相关脑区的发育过程,造成学习认知功能障碍,严重者还会导致抑郁症的发生[2]。抑郁症是以持续性的情绪低落为主要临床症状的情感类疾病[3]。据世界卫生组织[4]报道,全球大约有3.5亿人身处抑郁症的痛苦之中,它是一种发病率高、经济负担重的严重精神类疾病。因此,抑郁症已成为急需关注并迫切需要解决的公共卫生问题[5]。

抑郁症的三大症状为情绪低落、快感缺失和绝望无助[6]。抑郁症与内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)脑区[7]及情绪相关脑区关系密切[8-10]。PFC活动减弱[11],PS导致mPFC脑区神经元密度减少[8]。笔者未检索到有研究报道产前束缚应激对情绪相关脑区c-Fos神经元激活密度改变的影响,这对进一步探讨PS后情绪相关脑区功能的改变有一定意义,可为研究PS导致的抑郁症的发病机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.2 实验材料

鼠源多克隆抗-NeuN抗体(美国Millipore公司);鼠源多克隆抗-GAD67抗体(美国Sigma公司);鼠源多克隆CamKⅡα抗体(美国Sigma公司);兔源单克隆c-Fos抗体(英国CST公司);山羊抗兔488多克隆抗体(美国Millipore公司);山羊抗鼠594多克隆抗体(美国Millipore公司);蔗糖(上海麦克林生化科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 PS子代大鼠模型制备

PS组孕鼠每天给予3次束缚应激,起始时间分别为 8:45 am-9:30 am,11:45 am-12:30 am,15:45 am-16:30 am,每次45 min,每天共计135 min。从孕期第14天(pregnancy day 14, GD14)到孕期第20天(pregnancy day 20, GD20),一共束缚7 d,束缚盒为透明塑料盒,其正面有3个卡位,底面为黑色,束缚板也为黑色。头端具有呼吸小孔防止束缚孕鼠窒息,尾端有可使尾巴伸出来的小孔。将孕鼠放到束缚盒内,孕鼠不同孕期根据其身体体积的大小不同灵活调节挡板,以孕鼠在束缚盒内不能随意活动为最合适的束缚程度。每次束缚结束,将孕鼠放回原来饲养笼,清洗干燥束缚盒和挡板,以备下次使用。

1.3.2 子代大鼠分组

子代大鼠出生第一天,即产后第一天(postpartum day 1,PD1)。为避免数量不一致导致子代大鼠营养摄取偏差,每一只母鼠只留8只雄性子代。子代大鼠离乳前一直由母鼠哺乳,21 d离乳后分笼饲养,3只一笼。为了防止遗传因素的干扰以及子代大鼠个体差异,入组的子代大鼠采用数字表法随机选取自不同的母鼠。正常孕鼠的子代雄鼠为正常对照组(Ctrl组),产前束缚孕鼠的子代雄鼠成年时经行为学测试筛选出抑郁样行为大鼠作为产前应激组(PS组)。

1.3.3 抑郁样行为测试

蔗糖偏好测试(sucrose preference test,SPT):测试时大鼠不给予饲料。根据动物只数配置合适的糖水瓶和清水瓶对数。实验前将装有1 %(质量分数)蔗糖水的糖水瓶和装有清水的清水瓶称质量记录。随后将两瓶同时轻柔地插到蔗糖偏好测试笼箅子上,并且糖水瓶和清水瓶之间隔开固定距离;随后在安静无打扰的环境中让大鼠自由饮水 1 h。饮水结束后,动作轻柔地回收清水瓶和糖水瓶并进行称质量记录,计算糖水瓶及清水瓶实验前后质量差,将所得数据代入公式:A=B/(B+C)×100 %,计算每只大鼠的糖水饮用百分比。A:糖水饮用百分比;B:糖水饮用质量;C:清水饮用质量;B、C单位为g。

结合传输设备、蓄电池的实时/在线网管监测与检测数据、充放电实验数据、历史运行状态性能等动态数据，设备和业务统计资源静态数据、历史缺陷和检修工单等流程数据、设备动环信息等数据，建立设备状态变化分类预测模型，整体反应设备状态，感知设备状态和网络状态。

开放旷场测试(open field testing,OFT):采用动物开放旷场测试箱,底壁和四周壁均为黑色的敞口箱,旷场箱体积(100 cm×100 cm×30 cm),被平均分为25个同样大小的正方格。实验时保持正常光照,将大鼠轻轻放入箱底中心区域,让其在箱内自由探索,每一只大鼠在旷场箱内探索 6 min。箱底正上方的摄像机记录 5 min。使用稀释过的乙醇和干净纸巾将旷场箱底进行擦拭,尽量避免前一只测试大鼠气味对下一只大鼠测试结果的影响。采用ANY-maze行为学分析软件对大鼠在中央区停留时间进行统计分析。

强迫游泳测试(forced swim test,FST):实验时保持正常光照,将测试大鼠放入70 cm×40 cm水桶中游泳,水温控制在 (25 ± 2)℃,摄像机录像记录 5 min。将视频导入ANY-maze行为学分析软件统计每只大鼠的不动时间(大鼠停止挣扎并漂浮在水中或仅有必要的轻微动作以保持头部在水面以上)。

1.3.4 c-Fos免疫荧光染色

选取Ctrl组和PS组子代大鼠各6只,实验日备好70 cm×40 cm透明圆柱形水桶,实验前加入常温水至桶高的2/3处,保持水温在 (25 ± 2)℃。每次放入1只大鼠使其游泳5 min,5 min后将其放回原来的饲养笼。每只大鼠安稳放置一段时间后使用1%(质量分数)戊巴比妥进行麻醉灌注取材,从大鼠放回原饲养笼到灌注之间的时间间隔为90 min。

使用37 ℃的1 mol/L 磷酸盐溶液(phosphate solution, PB)+肝素钠溶液心脏灌注(1 mol/L PB,pH=7.30)冲刷血液2 min,37 ℃的4 %(质量分数)多聚甲醛(perfluorinated alkaline,PFA)灌注2 min,4 ℃的4 %(质量分数)PFA灌注15 min。立即解剖大鼠大脑放入4 ℃ 4 % (质量分数)PFA溶液过夜。脑组织依次在20%(质量分数)和30%(质量分数)的蔗糖溶液中脱水,直到组织下沉。将组织块嵌入OCT包埋冷冻并在冷冻切片机(莱卡,CM1950)上切片,获得35μm厚的切片。组织切片用1 mol/L PBS洗涤一遍,然后用0.3%(体积分数) Triton X-100在室温下打孔1 h,3%(体积分数) Triton X-100在室温下封闭1 h。组织切片随后用兔源c-Fos抗体(1∶500)和小鼠源NeuN(1∶1 000)在4 ℃下孵育2夜。一抗孵育后,切片用1 mol/L PBS洗涤3次,并与山羊抗兔Alexa Fluor 488和山羊抗小鼠Alexa Fluor 594(1∶1 000)在室温下孵育2 h。细胞核用4,6-二氨基2-苯乙烯醇(DAPI)荧光封片剂染色。

图像采集采用20 ×物镜下的共聚焦显微镜(莱卡SP8)。量化mPFC、基底外侧杏仁核(basolaterel amygdala, BLA)、腹侧海马(ventral hippocampus,VH)、腹外侧导管周围灰质(ventrolateral periaqueductal gray,vlPAG)脑区的c-Fos+神经元密度和c-Fos+神经元占NeuN+神经元的比例。c-Fos+神经元密度为计算1 mm2内c-Fos+神经元的数量;c-Fos+神经元占总NeuN+神经元的比例为c-Fos+NeuN+神经元的数量占总NeuN+神经元的比例。

1.4 统计学方法

所有行为学和形态学的数据分析使用双盲法,双人双次将行为学视频导入行为学分析软件,形态图片导入Image J 软件进行统计分析,尽量避免人为失误。

2 结果

2.1 PS导致子代雄性大鼠产生抑郁样行为

蔗糖偏好测试中PS组糖水偏好率明显低于对照组(图1A);开放旷场测试中PS组在中心区停留时间较对照组减少(图1B); PS组强迫游泳不动时间较对照组明显延长(图1C),表现出快感缺失和绝望无助。

图1 PS导致子代大鼠产生抑郁样行为Fig.1 PS leads to depression behavior in offspring male rats

2.2 PS后,子代大鼠mPFC脑区应激敏感性神经元密度下降

如图2A所示,PS组在FST后mPFC中c-Fos+细胞与正常对照组相比,密度降低(53.82 ± 0.54vs80.45 ± 0.62,P<0.01,图2B),比例下降(4.895 ± 0.360vs7.924 ± 0.691,P<0.01,图2C)。

图2 PS子代大鼠mPFC脑区应激敏感性神经元密度下降Fig.2 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the mPFC brain region of the offspring rats decreased

2.3 PS后,子代大鼠BLA脑区应激敏感性神经元密度下降

PS子代成年大鼠BLA脑区c-Fos+细胞密度(PS组: 66.76 ± 5.24,Ctrl组:71.26 ± 5.16,P<0.01)和NeuN+细胞中c-Fos++NeuN+细胞的百分比与对照组相比(PS组: 6.386 ± 0.440,Ctrl组:8.758 ± 0.518,P<0.01)均降低(图3)。

图3 PS子代大鼠BLA脑区应激敏感性神经元密度下降Fig.3 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in the BLA region of the offspring rats decreased

2.4 PS子代大鼠VH脑区应激敏感性神经元密度下降

PS子代成年大鼠VH脑区c-Fos+细胞密度与Ctrl组相比下降(PS组: 78.43 ± 2.53,Ctrl组:86.86 ± 3.09,P<0.05)。NeuN+细胞中c-Fos++NeuN+细胞的百分比与Ctrl组相比,差异无统计学意义(PS组: 4.565 ± 0.365,Ctrl组:4.426 ± 0.322,P>0.05)(图4)。

图4 PS子代大鼠VH脑区应激敏感性神经元密度下降Fig.4 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the VH brain region of the offspring rats decreased

2.5 PS子代大鼠vlPAG脑区应激敏感性神经元密度不变

PS子代成年大鼠vlPAG脑区中c-Fos+细胞密度(PS组: 111.0 0± 5.18,Ctrl组:106.10 ± 17.02,P>0.05)和NeuN+细胞中c-Fos++NeuN+细胞的百分比(PS组: 8.396 ± 0.881,Ctrl组:8.300 ± 1.639,P>0.05)与Ctrl组相比,差异均无统计意义(图5)。

图5 PS子代大鼠vlPAG脑区应激敏感性神经元密度不变Fig.5 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in vlPAG brain region of offspring rats remained unchanged

3 讨论

本实验结果表明PS会导致子代雄性大鼠产生焦虑抑郁样行为,表现为糖水偏好测试中糖水饮用率明显降低;开放旷场测试中,中心停留时间较正常对照组减少;强迫游泳测试中,PS组较正常对照组不动时间明显延长;表现出快感缺失和绝望无助症状即出现抑郁样行为。上述行为变化结果与先前研究报道一致[12-13]。

本研究结果显示,PS子代大鼠mPFC脑区应激敏感性神经元密度下降,之后根据文献[14]报道方法先进行5 min强迫游泳实验作为应激源,取材后对脑片进行c-Fos与NeuN免疫荧光染色,发现应激敏感性神经元占总神经元的比例下降。由此可知,PS后,在mPFC脑区c-Fos阳性神经元数量下降时,主要是NeuN与c-Fos共标的阳性神经元下降才导致应激敏感性神经元比例下降。PS后,子代大鼠BLA脑区及VH脑区应激敏感性神经元密度下降,PS损害了海马的形态发育,包括神经发生和神经元分化。PS后,子代大鼠vlPAG脑区应激敏感性神经元密度不变。

本实验结果与其他应激相关文献[8]研究报道类似,情绪相关脑区与抑郁症密切相关,一方面,是抑郁相关环路中的重要中枢调控思维和情绪[15]。另一方面,重度抑郁症患者功能磁共振成像[16]显示血流量和葡萄糖代谢减少。在产前听觉应激动物模型上[8],mPFC脑区神经元密度减少。已有报道[17]显示,mPFC脑区体积减小,神经元和胶质细胞数量减少。抑郁症和慢性应激暴露会导致与抑郁症有关的皮质和边缘脑区域的神经元萎缩,脑成像研究表明抑郁症患者大脑的连通性和网络功能发生改变。脑皮质损伤后c-Fos的短暂激活与抑郁症的扩散模式相似[18]。研究[19]表明,PS子代大鼠海马(hippocampus, HIP)和前额叶皮质中c-Fos蛋白和mRNA水平降低。小鼠经PS后,短期行为应激治疗可改善慢性束缚应激(chronic restraint stress, CRST)小鼠调节应激对应的mPFC、BLA脑区c-Fos密度下降这一改变[20],这与本实验变化趋势一致。经历2次轻度听觉应激的产前压力小鼠纹状体(corpus striatum, STR)及海马脑区c-Fos蛋白表达增加与血清转运体(serotonin transporters, SERT)有关且变化趋势一致[21]。PS除了影响总神经元激活数量,还对单个神经元的树突棘密度和突触造成影响。研究[22]显示,在GD12-16时给予每天2次(9:00 am-3:00 pm),每次30 min的束缚应激大鼠模型中,眶额叶皮质(orbitofrontal cortex, OFC)、mPFC和海马CA1区(hippocampus CA1 region)树突形态和实际神经元体积发生改变。导致PFC锥体神经元顶端树突棘密度降低,海马CA1区蘑菇棘比例降低[23]。鉴于蘑菇棘被认为更“成熟”可形成比其他棘更强更稳定的突触类型,蘑菇棘密度下降,机体树突因为代偿可能表达更多的非成熟棘补偿突触的损失[24]。树突棘密度的动态平衡是兴奋性突触自身调节的结果[25],树突棘的密度和形态改变与神经发育[26]及以认知障碍为特征的疾病密切相关。本实验结果表明PS会导致子代雄性大鼠产生焦虑抑郁样行为;会导致mPFC、BLA和VH脑区应激敏感性神经元密度下降,提示神经元的兴奋性可能降低。vlPAG脑区应激敏感性神经元密度不变,说明并非所有情绪相关脑区应激敏感性神经元密度在PS后发生改变,可能提示产前应激对vlPAG脑区c-Fos阳性神经元无影响。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明李志恒:提出研究思路,设计研究方案,进行实验操作,采集分析数据,撰写论文;于鑫、袁莹:协助进行动物实验;协助分析数据;徐志卿:总体把关,审定论文。