胃癌组织中lncRNA CHRF、miR-489的表达变化及意义

邓小婧，辜正策，李璐池，刘欣，杨炎鑫

眉山市中医医院病理科，四川眉山 620032

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均位于恶性肿瘤前列［1］。目前胃癌的治疗方法主要包括手术治疗、放化疗及靶向治疗等，早期胃癌患者经治疗后预后良好，但由于胃癌常隐匿发病，早期临床症状及体征不具备特异性，多数患者确诊时已经是中晚期，治疗后预后较差［2-3］。研究胃癌发生发展的分子生物学机制对于胃癌的诊断及治疗具有重要意义。长链非编码核糖核酸（lncRNA）是一种非蛋白编码核糖核酸（RNA），已有多种lncRNA 被证实与胃癌细胞的增殖、转移有关［4-5］，但关于lncRNA CHRF 与胃癌关系的研究较少。微小RNA（miRNA）存在于大多数生物中，其通过调控靶基因实现对肿瘤的调控，与肿瘤的发生与发展密切相关。miR-489 是miRNA 家族成员之一，已被证实与乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤的发生有关［6-8］。研究表明，肿瘤相关成纤维细胞外泌体miR-489可通过靶向抑制Twist1表达，参与胃癌的病理变化过程［9］。上皮间质转化（EMT）是指上皮细胞在一定因素的作用下由上皮表型向间质表型转化的生物学过程，与胃癌的发生及病理进展相关［10］。本研究观察了胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489 的表达变化，并探讨其与患者病情严重程度、EMT 及预后的关系，为胃癌的临床诊治及预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：①符合胃癌的临床诊断标准［11］，并经病理学检查确诊；②入组前未接受任何抗肿瘤治疗；③符合根治性手术适应证［12］；④临床病理资料完整；⑤无精神性疾病。排除标准：①合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全；②合并其他恶性肿瘤；③合并严重感染、免疫系统疾病；④合并脾功能亢进、高尿酸血症。选择2018 年1 月—2020 年1月在眉山市中医医院进行根治手术治疗的胃癌患者63 例，男41 例、女22 例，年龄（51.48 ± 8.84）岁。本研究通过我院伦理委员会批准（伦审2017 第0631号），患者及家属均签署知情同意书。

1.2 胃癌及癌旁组织lncRNA CHRF、miR-489 检测 采用实时荧光定量PCR 法。术中收集患者的胃癌组织和癌旁组织样本，癌旁组织样本采集区域需距肿瘤组织边缘≥5 cm；组织样本采集后分成两份，一份即刻置于液氮中快速冷冻，-80 ℃保存；另一份经4%中性甲醛固定，石蜡包埋后4 µm 厚度连续切片。取冷冻后的胃癌及癌旁组织，TRIzol 试剂盒提取总RNA，逆转录获取cDNA。采用2720 型热循环PCR 系统和SYBR Green Mix 试剂盒进行PCR反应，2-ΔΔCt法计算lncRNA CHRF、miR-489相对表达量。

1.3 胃癌及癌旁组织EMT 相关蛋白检测 采用Western blotting 法。取胃癌及癌旁组织切片，进行常规脱蜡、水化处理，置于0.01 mol/L、95 ℃的枸橼酸缓冲液中浸泡并进行热修复。加入RIPA buffer裂解液充分裂解后提取总蛋白，采用BCA 法定量蛋白，取20 µg 总蛋白进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转移至聚偏氟乙烯膜。加入5%脱脂奶粉封闭60 min，依次加入鼠抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentine）、锌指蛋白转录因子（Snail）一抗及二抗，温室孵育。以GAPDH 为内参，增强型化学发光试剂发光后采用Image-Pro Plus 软件分析目的条带灰度值，计算E-cadherin、Vimentine、Snail蛋白相对表达量。

1.4 预后评价 患者出院后定期门诊复查和电话随访，随访时间截至2023年1月，随访终止事件为患者死亡或随访到期，记录患者的3年生存率。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，结果比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，结果比较采用秩和检验。胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489与E-cadherin、Vimentine、Snail的关系采用Pearson相关分析法。根据lncRNA CHRF、miR-489 的平均值将患者分为lncRNA CHRF 高表达和低表达者、miR-489 高表达和低表达者，绘制其Kaplan-Meier 生存曲线，并比较其3 年生存率。以胃癌患者的预后（赋值：1 = 死亡，0 = 生存，t = 生存期）为因变量，以患者临床特征为自变量，进行单因素及多因素COX回归模型分析；因本研究的样本量较少会影响多因素分析，特采取以下两种措施：一是对所有自变量指标进行降维处理（连续变量均按总均值转化成两分类变量），二是采用逐步前进法（α留=0.05，α剔=0.10），把可能被剔除的指标因素（P值偏大的、HR值接近1的）先加入至回归模型，使其先被剔除而不影响后续回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织lncRNA CHRF、miR-489及E-cadherin、Vimentine、Snail 蛋白相对表达量比较 见表1。

表1 胃癌组织与癌旁组织lncRNA CHRF、miR-489及EMT相关蛋白相对表达量比较（）

表1 胃癌组织与癌旁组织lncRNA CHRF、miR-489及EMT相关蛋白相对表达量比较（）

注：与癌旁组织比较，*P＜0.05。

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2.2 不同临床特征的胃癌患者胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489表达比较 见表2。

表2 不同临床特征的胃癌患者胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489表达比较（）

表2 不同临床特征的胃癌患者胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489表达比较（）

注：不同临床特征之间比较，*P＜0.05。

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2.3 胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489与E-cadherin、Vimentine、Snail 表达的关系 胃癌组织lncRNA CHRF与E-cadherin表达呈负相关关系（r= -0.539），与Vimentine、Snail 表达呈正相关关系（r分别为0.497、0.522），P均＜0.05。胃癌组织miR-489 与E-cadherin表达呈正相关关系（r= 0.512），与Vimentine、Snail 表达呈负相关关系（r分别为-0.506、-0.508，P均＜0.05）。

2.4 胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489 高低表达者的预后比较 63 例患者均获得随访，无失访病例，随访3 年共生存46 例，3 年生存率为73.02%。胃癌组织lncRNA CHRF 高表达者3 年生存率为55.56%（15/27），低表达者为86.11%（31/36），两者比较P＜0.05；胃癌组织miR-489 高表达者3 年生存率为93.33%（28/30），低表达者为54.55%（18/33），两者比较P＜0.05。见OSID码图1、2。

2.5 胃癌组织lncRNA CHRF、miR-489 表达对患者预后的影响 影响胃癌患者预后的单因素COX 分析结果见表3，多因素COX分析结果见表4。

表3 影响胃癌患者预后的单因素COX分析结果

表4 影响胃癌患者预后的多因素COX分析结果

3 讨论

胃癌的发生与发展是多因素、多基因参与的复杂过程，对患者的身体健康及生命安全具有巨大威胁。目前，手术是胃癌的主要手治疗段，但一些中晚期胃癌患者存在术后复发率高、生存率低的问题。lncRNA作为一种非蛋白编码RNA，其异常表达在肿瘤的发生发展过程中具有特殊的调控机制，多种lncRNA（如HOTAIR、ANRIL、GAPLINC 等）参与了胃癌细胞生物学行为（如细胞生长、增殖、凋亡及转移）的调控，且与肿瘤进展过程密切相关［13］。miRNA通过作用于靶信使RNA 参与细胞增殖、分化、凋亡过程，人类miR-489 定位于7 号染色体，主要表现为抑癌功能，在多种恶性肿瘤中呈低表达，通过调控靶基因的表达参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁徙及转移过程［14］。研究显示，lncRNA CHRF 作为miR-489 的天然“海绵”，通过靶向调节Myd88表达，抑制血管紧张素Ⅱ生成，在肥大心肌细胞中表达特异性升高，并诱导心肌肥厚的发生［15］。研究显示，lncRNA CHRF可吸附miR-489，解除其对靶基因MyD88 和Smad3的抑制作用，从而激活炎症和纤维化信号通路，在肺纤维化的发生中发挥了关键作用［16］。本研究结果显示，胃癌组织lncRNA CHRF 表达高于癌旁组织、miR-489 表达低于癌旁组织，并与胃癌患者的临床分期和分化程度有关，TNM 分期越高、分化程度越低的胃癌组织表达变化越明显，提示二者与胃癌的发生及病情严重程度有关。

EMT 存在于多种恶性肿瘤的浸润及转移过程中，表现为肿瘤上皮细胞受到细胞外因子刺激后失去极性，转化为间质细胞，导致细胞迁徙和运动能力增强，肿瘤浸润和转移能力升高。研究表明，EMT活性与胃癌的发生发展密切相关［17］。虽然发生EMT 的细胞类型和组织环境会有差异，但发生EMT的过程会存在一些共同特征，通过检测EMT 相关蛋白可反映上皮细胞的EMT 状态。E-cadherin 作为细胞黏附连接的关键分子，是EMT 的重要标志物，其表达下降时常伴有Wnt 通路激活，减弱了GSK3β 对Snail 的抑制作用，从而促进EMT 的发生。Snail、Vimentine 与启动因子结合后引起转录抑制，可降低E-cadherin 表达，促进EMT 过程。本研究结果显示，胃癌组织Vimentine 和Snail 蛋白表达高于癌旁组织，E-cadherin 蛋白表达低于癌旁组织，提示胃癌细胞存在EMT 过程。分析其机制，可能是当胃癌发生后，黏附分子及基因表达发生病理性改变，启动因子胞嘧啶—磷酸—鸟嘌呤基序岛区过度甲基化，活性过氧化物、转化生长因子β（TGF-β）及凋亡信号传导途径相关基因表达升高，造成肿瘤组织E-cadherin表达降低，而E-cadherin 表达降低可使肿瘤细胞间黏附作用降低或丧失，导致肿瘤细胞更容易迁徙和转移；Vimentine 表达升高可激活C-src 原癌基因，进一步使限速酶己糖激酶磷酸化，为肿瘤的生长及转移提供有利条件；Snail 可通过与E-cadherin 启动子区的作用元件E-box 结合，从而抑制E-cadherin 转录，参与胃癌的发生及病理进展过程。本研究结果显示，miR-489 表达与E-cadherin 呈正相关关系，与Vimentine 和Snail 呈负相关关系；而lncRNA CHRF 表达与E-cadherin 蛋白呈负相关关系，与Vimentine、Snail 呈正相关关系。研究显示，miR-489 通过靶向抑制Twistl 在胃癌细胞中的表达，从而抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭过程，同时miR-489 可通过抑制EMT 过程，参与抑制胃癌细胞的生长与病理进展；此外，miR-489 可直接调控靶基因（如Akt3、PTPN11、MyD88 等）及相关通路，影响胃癌细胞的生物学行为［18］。因此，miR-489 可通过多种途径对胃癌细胞形成复杂的调控网络，最终影响胃癌的发生及进展过程。而当miR-489 表达降低时，其对胃癌细胞及EMT 过程的抑制作用减弱，更有利于肿瘤细胞的生长及病理进展。lncRNA CHRF 可能通过调控EMT 相关蛋白和miR-489 表达，参与调控胃癌细胞的增殖、侵袭、转移过程，然而其具体的信号通路尚需进一步研究。

本研究结果显示，lncRNA CHRF 高表达者3 年生存率低于lncRNA CHRF 低表达者，miR-489 高表达者3年生存率高于miR-489低表达者，进一步分析显示胃癌组织lncRNA CHRF 表达升高及miR-489表达降低是影响患者预后的独立危险因素。推测lncRNA CHRF 表达上调、miR-489 表达下调更有利于胃癌细胞的浸润和转移，导致转移灶隐匿性发展，从而使手术难以切除所有的病灶，增加了患者复发及术后死亡的风险。另外，癌组织lncRNA CHRF 表达上调可促进胃癌细胞的EMT，促进肿瘤分化、转移的同时，增加了辅助治疗药物的耐药性，从而影响患者预后［19］。

综上所述，胃癌组织lncRNA CHRF 表达升高、miR-489表达降低，二者参与了EMT 的发生，并与患者的病情严重程度及预后有关。lncRNA CHRF 高表达和miR-489 低表达是胃癌预后的独立危险因素，可作为胃癌诊疗的特异性生物标志物。