BRD4在多种肿瘤中表达情况的研究进展

王维铭 王彩霞

佳木斯大学第一附属医院病理科,黑龙江省佳木斯市 154002

溴蛋白结构域4(Bromodomain and extraterminal domain 4,BRD4)是BET家族成员之一,该基因家族主要包括BRD2、BRD3、BRD4,其中BRD4有三种不同形式的剪切体。BRD4为其家族蛋白中机制研究较为清晰的蛋白,除了能够通过BRD结构域来结合乙酰化修饰的组蛋白外,BRD4还能与其他一些蛋白如P-TEFb、Mediator形成蛋白复合物,P-TEFb蛋白能够与CDK9发生相互作用并通过磷酸化来增加RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)的转录活性,以此来激活下游基因的表达。BRD4被证明参与多种肿瘤的发生、发展过程。

1 BRD4在胃肠道间质瘤中的研究

圣地亚哥.卡哈尔首次记录了由周围神经支配的器官周围的神经样细胞,并将这些细胞称为Cajal间质细胞(ICC),并发现这些细胞广泛存在于胃肠璧的肌层,而且发现这些细胞具有一定的起搏、协调肠壁整体运动的功能[1],在最初发现的一些样本中,其中有9例既没有平滑肌(即拥有超微结构研究中的细胞质肌丝的特征)也没有施旺细胞特征。然而,在显微镜下观察,这些肿瘤细胞拥有以下特征:细胞突起、原始连接和较大的细胞质空泡。得出结论,许多胃壁肿瘤实际上并非来源于平滑肌,并创造了“胃间质瘤”一词。

有研究表明,BRD4在胃肠道间质瘤中的表达升高。首先:Mu J等人[2]将pcDNA-3.1(+)-BRD4 载体转染到GIST-882 和 GIST-T1 细胞系中,通过测量BRD4含量得知在胃肠道间质瘤中BRD4表达上升。通过细胞活力测定实验得知,BRD4转染过后的细胞系相比较于对照组,呈现出更高的细胞生长活力。这些结果均表明,BRD4会刺激胃肠道间质瘤的生长。其次:BRD4也被观察到具有刺激血管增生的作用。肿瘤的生长需要毛细血管为其提供营养支持,而测量血管的指标则是肿瘤细胞分泌的血管生成因子,例如 bFGF、PDGFB 和 VEGF。同样的,转染BRD4的实验组其肿瘤分泌的血管生长因子表达含量相对于对照组较高,敲除BRD4基因组的胃肠道间质瘤组,其肿瘤分泌的血管生长因子表达含量相对较低。故可见BRD4在胃肠道间质瘤中有促进肿瘤相关毛细血管生长的作用。再次:BRD4可以促进CCL2的激活,进而促进肿瘤的增殖。通过实时定量PCR实验(qRT-PCR)测定得知,实验组的CCL2表达量上升,而对照组的CCL2的表达量降低,通过ELISA实验同样证明了CCL2的表达量降低。这表明了BRD4可以促进胃肠道间质瘤中的CCL2的表达。该实验的潜在机制[3]研究,用NF-κB信号通路的特异性阻断剂IMD0354,3μg作用于该通路上,测量了用特异性抑制剂预处理30min并用HCV核心蛋白处理24h的MΦ-THP-1上清液中CCL2的蛋白水平。阻断NF-κB途径显著降低CCL2的表达。结果表明,NF-κB通路在接受HCV核心蛋白治疗的巨噬细胞的CCL2表达中起重要作用[4]。而CCL2的激活会刺激肿瘤相关巨噬细胞的聚积活跃,在胃肠道间质瘤的肿瘤细胞及肿瘤间质中,通过免组织化学染色均发现CD68呈阳性表达,用 BRD4 转染的培养基中的细胞显示,单核细胞被激活为巨噬细胞,证明 BRD4 水平的增加会激活 TAM。最后:有研究表明,CCL2的上调可以加剧Treg的招募从而诱导肿瘤细胞的增殖[5]。目前的研究证明,手术后的损伤可能导致CCL2表达增加,促进肿瘤生长,并促进Treg细胞的增殖。目前主要的发现如下:第一,手术创伤促进肿瘤生长,增加CCL2的表达和Treg的募集;CCL2表达与Treg丰度呈正相关。其次,抗CCL2抗体的加入降低了CCL2的表达以及Treg百分比及迁移,并抑制了体内肿瘤的生长。第三,CCL2的高表达和外周血中Treg浸润的增加影响肿瘤的预后。通过正反两方面的验证,证明了CCL2与Treg之间是正相关。总而言之,研究表明,手术创伤可以通过增加CCL2表达促进Treg募集,从而形成免疫抑制环境并促进肿瘤细胞的进展。这些结果强烈表明,CCL2可能是一种新的术后干预方法,以防止复发。Treg细胞在自身免疫应答中可以限制自身免疫所导致的组织损伤,但是为肿瘤逃逸提供了条件。Treg细胞导致肿瘤逃逸的机理:Treg表达CD25,能够消耗大量的IL-2,与T细胞竞争性的抑制,从而导致CD4+及CD8+等淋巴细胞生成减少;在肿瘤微环境中 Treg 细胞可以表达颗粒酶B,以颗粒酶B/穿孔素依赖的方式使NK、CTL等细胞溶解,抑制机体抗肿瘤免疫;再者Treg细胞容易聚集于肿瘤组织局部,从而导致机体对于肿瘤组织的不应答,加剧肿瘤逃逸的过程,利于肿瘤的增殖生长;还有研究表明,Treg细胞上的CD27可以促进肿瘤生长[6],并且将Treg细胞上的PD-1通路阻断和CD27的缺乏可协同限制肿瘤生长。而上诉已经说明,BRD4可以通过NF-κB通路,促进CCL2的表达,故BRD4与Treg之间是具有相关性的。以上几个方面均说明了BRD4可以促进胃肠道间质瘤的增殖。故研究BRD4与胃肠道间质瘤临床病理学相关性的关系可以为今后诊断和治疗提供新思路。

2 BRD4在胃癌中的研究

目前已经有多篇文献研究表明,BRD4在多种肿瘤疾病中发挥作用,且已经成为许多肿瘤的潜在靶点。在胃癌中, BRD4在癌细胞中有显著的表达。并且,在肿瘤组织中敲除了BRD4基因之后,肿瘤的增殖活性、增殖速度及ALDH1活性方面均显著下降。重要的是,BRD4的表达与胃癌患者的总生存率、首次进展生存率和进展后生存率呈负相关。有相关机制性的研究表明,BRD4的敲除基因中,最显著上调的miRNA是miR-216a-3p,Wnt/β-catenin信号通路是BRD4介导的胃癌细胞干细胞增殖所必需的此外,BRD4直接与启动子结合,促进了miR-216a启动子的甲基化水平,Wnt3a被确定为胃癌细胞中miR-216a-3p的直接靶点,研究结果确定了BRD4/miR-216a-3p/Wnt/β-catenin途径在调节胃癌细胞的干细胞中起到了至关重要的作用[7],以通过C-MYC信号通路的转录及表观遗传学从而对胃癌组织进行增殖。已经有研究表明,BRD4 可以作为表观遗传的“阅读器”并通过溴结构域识别 H3 和 H4 中的乙酰化的赖氨酸残基。通过读取乙酰化组蛋白密码,BRD4 与乙酰化 的H3 和 H4 结合[8]以调节与许多相关细胞参与的基因的转录有关,例如生长、凋亡、炎症等。

2019年Qin ZY等[9]研究显示,癌症转移作为导致死亡的最常见原因与遗传表观修饰的异常表达有关。BRD4作为一种乙酰化的组蛋白和新兴的抗癌治疗靶点,可促进胃癌的进展和转移。人体中BRD4的含量多少与无远处转移胃癌患者的短期生存率有关。同样的,BRD4在体外同样发挥着促进肿瘤细胞的增殖能力。故BRD4在胃癌的发展中起到重要的作用。

3 BRD4在食管鳞状细胞癌中的研究

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤,主要分为两大组织病理学类型:食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌。受饮食、遗传等因素影响,我国97%以上的食管癌为食管鳞状细胞癌。 一直以来,食管鳞状细胞癌生存率偏低的主要原因受限于目前存在的手术技术问题及对于食管鳞状细胞癌的分子机制尚不完全明确所致。2022年Wu Q等人[10]研究发现,BRD4在食管鳞状细胞癌中的发生发展起着关键作用,在食管鳞状细胞癌患者组织中,BRD4的转录物和蛋白质表达水平显著增加。通过机理研究表明,RCC2 是 BRD4 的下游靶目标。BRD4或RCC2的抑制导致食管鳞状细胞癌细胞增殖减少。BRD4-TP73 相互作用促进了 BRD4 复合物与 RCC2 的启动子区域的结合,并随后调节了RCC2的转录。此外,用BRD4的靶向抑制剂作用于肿瘤组织,结果显示显著降低了模型中的肿瘤体积,这表明BRD4的表达可能有助于肿瘤进展[10]。总的来说,这些发现表明BRD4抑制可能成为一种通过下调RCC2来治疗食管鳞状细胞癌前景的策略。此外,用抑制剂靶向抑制BRD4,结果显示显著降低了目的模型中的肿瘤体积。

已经有研究表明,BRD4是一种乙酰化的组蛋白,由组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)动态控制,是一种主要类型的表观遗传修饰,通过调节染色质结构和基因转录在许多生物过程中发挥关键作用。许多HDAC的突变和/或异常表达已在癌症中得到证实[11]。 因此,HDAC抑制剂(HDACIs)被认为是有希望对抗食管鳞状细胞癌的治疗剂,组蛋白乙酰化水平升高被认为与基于HDACI的抗癌治疗有关。BRD4属于BET家族的含溴结构域蛋白,BRD4的作用是调节转录的组蛋白乙酰赖氨酸残基,从而发挥作用。故BRD4在研究食管鳞状细胞癌的发生发展及其分子机制上存在巨大的价值。

4 BRD4在乳腺癌中的研究

乳腺癌(Breast cancer)是女性最容易罹患的恶性肿瘤,全球范围内大约有12%的女性受此影响[12]。目前MYC基因的研究在乳腺癌中具有广泛前景。MYC基因,尤其是C-MYC被称为“超级转录因子”,因为它们调节控制多种代谢途径的大量基因的转录。含有溴结构域和额外末端结构域的蛋白质包括 BRD2、 BRD3和 BRD4,是染色质重塑表观遗传蛋白,通过调节染色质结构和基因转录在许多生物过程中发挥关键作用,因此在癌症进展、侵袭和转移中发挥重要作用。有报道称BRD4的扩增可以转录激活C-MYC[13],从而调节肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。RAC1(Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1)的扩增已显示可促进肿瘤的转移、侵袭、迁移、上皮间质转化(EMT)、血管生成、细胞周期进程和调节耐药性等[14]。乳腺癌的脑部转移在所有肿瘤脑转移中排第二位,有10%～30%的乳腺癌病例有脑部转移的发生[15]。乳腺癌脑部转移的主要临床表现为认知功能和感觉功能的异常,当患者出现乳腺癌脑转移后,其1年后的死亡率可以高达80%[16]。但是即使如此,我们对乳腺癌脑转移的机制及发生过程并不完全知晓,其生物学机制方面还需要更多的研究。我们迫切需要确定乳腺癌脑转移的细胞和分子机制,为开发新的诊断生物标志物和治疗靶点提供基础。环状RNA(circRNA)是新兴的内源性非编码RNA亚群。CircRNA是单链、共价闭合的RNA分子,由前体mRNA的反向剪接产生[17]。作为一种新型的circRNA,其在乳腺癌脑转移中的生物学功能和分子机制有待阐明。在研究中,发现 circBCBM1在体外显著促进 231-BR 细胞的增殖和迁移以及在体内的生长和脑转移。进一步的研究表明,circBCBM1可以作为一种捕获has-miR-125a-5p(简称miR-125a)的介质,通过Sonic Hedgehog(SHH)信号通路上调含溴结构域4(BRD4),然后上调基质金属肽酶9(MMP9)。因此环状RNA circBCBM1通过调节miR-125a/BRD4轴促进乳腺癌脑转移。总之,研究表明,circBCBM1在体外促进 231-BR 细胞增殖和迁移,在体内促进肿瘤细胞的生长和脑转移。从机制上讲,circBCBM1通过充当 miR-125a的捕获器来增加BRD4的表达。重要的是,circBCBM1在脑转移患者的组织和血浆样本中上调。究阐明了circBCBM1通过circBCBM1/miR-125a/BRD4轴加速了乳腺癌脑转移,为乳腺癌脑转移的诊断和治疗提供了创新的候选靶点。

5 BRD4在前列腺癌中的研究

前列腺癌(Prostate cancer)是常见的恶性肿瘤,同样也是导致西方国家男性死亡率第二高的恶性肿瘤,尽管雄激素剥夺疗法(ADT)在癌症治疗的初级阶段有效[18],但PCa患者在ADT治疗18～24个月后不可避免地复发为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),而一旦发展成为去势抵抗性前列腺癌,则其术后中位生存期不到20个月,几乎无法治愈[19]。含溴结构域蛋白4(BRD4)属于BET家族,据报道它在包括前列腺癌在内的多种癌症中发挥致癌作用,其本质是核蛋白。BRD4可以通过其溴结构域与乙酰化的组蛋白赖氨酸残基结合,并进一步招募转录因子以激活下游基因表达[20]。因此,BRD4 抑制剂,如 JQ1 和 Ibet-762,已被开发用于靶向 BRD4 进行抗肿瘤治疗[21], 这些抑制剂主要通过与溴结构域竞争性抑制来组织其与组蛋白结合。因此,可为癌的诊断与治疗提供新的思路。

由于雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)很容易转变为难治性去势抵抗性前列腺癌(CRPC),从而降低患者的生存率及生活质量,对患者及家庭带来了经济和心理的负担。Guan H等人[22]于研究发现,一种MicroRNA(miRNA)由一系列短序列的(18～22个核苷酸)非编码、单链RNA分子组成。miRNA可以选择性地结合下游靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR),并促进其降解。多种致癌因子,如 miR-203、miR-410 和 miR-34a,已被确定为促进前列腺癌细胞增殖的致癌因子[23],miR-200a 是 miR-200家族的成员,已显示参与调节肿瘤进展的多种生物学过程。通过研究发现,雄激素依赖性前列腺癌组织中miR-200a的表达存在差异。在雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)组织和去势抵抗性前列腺癌(CRPC)组织中,定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)证实miR-200a在去势抵抗性前列腺癌CRPC患者的癌组织中显著降低。统计分析还显示,miR-200a是前列腺癌患者预后的独立危险因素[23]。此研究还发现,含溴结构域蛋白4(BRD4)是miR-200a的潜在下游靶基因,通过蛋白质印迹分析验证了miR-200a与BRD4之间的关联。结果表明,miR-200a作为一种抗癌因子,通过抑制BRD4介导的雄激素受体(AR) 信号传导来抑制去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的进展。故得出结论,BRD4可作为抑制去势抵抗性前列腺癌的下游靶点来进行研究,对其的发生发展及预后质治疗提供新的思路。

6 BRD4在非小细胞肺癌中的研究

非小细胞肺癌是一种原发性肺癌,在各个国家的肿瘤发生率中都占据着很大一部分,就我国而言,导致肺癌发生的最主要原因是吸烟,我国成年男性,大约2/3的中国成年男性是吸烟者,占全球吸烟者的1/3。而在肺癌发生的病例中,有相当大的一部分是非小细胞肺癌,在非小细胞肺癌的治疗手段中,化疗是很重要的一种方法,以铂类为基础的化学疗法和放射疗法已被广泛使用[24]。PD-L1在人类所患的很多肿瘤中均有表达,据报道PD-L1有19.6%～65.3%在NSCLC中表达[25]。有报道称,顺铂通过 cGAS/STING 途径增加PD-L1表达[26]。前文已经提过,含有溴结构域和额外末端结构域的蛋白质包括 BRD2、 BRD3和BRD4,是染色质重塑表观遗传蛋白,通过调节染色质结构和基因转录在许多生物过程中发挥关键作用,JQ1作为BRD4的抑制剂而存在。最近有研究说明,JQ1通过抑制肿瘤中PD-L1表达和干扰素γ(IFN-γ)刺激的PD-L1表达来调节肿瘤免疫微环境(TIME),进而引发肿瘤免疫原性提高 T 细胞和自然杀伤(NK)细胞的活性。因此,基于以上几个方面,BRD4调节非小细胞肺癌的治疗免疫微环境和限制肿瘤进展有很大影响。

7 小结

BRD4因子在多种肿瘤中均参与表达,通过NF-κB通路促进CCL2的表达,从而使肿瘤相关巨噬细胞聚积等多种途径增加肿瘤逃逸的机会,促进肿瘤生长。BRD4在多种肿瘤中高表达提示该因子可能参与多种肿瘤的发生发展过程,故BRD4可能将成为新的肿瘤免疫靶点,对肿瘤的诊断、治疗及预后提供新的思路。