人脐带间充质干细胞来源工程化纳米囊泡的制备与鉴定

李磊，杜飞跃，杨文杰

（南京今阳生物科技有限公司，江苏南京 211899）

干细胞外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是由干细胞释放的一种纳米囊泡，内部包含蛋白质、脂质和核酸等多种生物分子，这些生物分子可以被其他细胞摄取，从而影响受体细胞的功能[1]。干细胞EVs可以用于治疗多种疾病，包括心血管疾病[2]、神经退行性疾病[3]等。与干细胞疗法相比，EVs 具有更好的安全性和更低的免疫原性，因此被认为是一种干细胞的替代疗法[4]。尽管EVs 在治疗上具有许多潜在优势，但制备过程存在一些缺点：干细胞EVs 的产量通常比较低，难以进行大规模生产，生产成本高昂。这些缺点可能限制了EVs 的临床应用[5-6]。

为了解决低产量问题，通过挤压、研磨、超声等破碎干细胞的技术产生工程化纳米囊泡（Nanovesicles，NVs），成为一种新的具有潜力的生产方法[6-9]。其中，超声破碎技术通过产生周期性的高频振动波，在细胞中形成微气泡并引发空化，细胞瞬间坍塌产生强大的流体力学剪切力，可以剪切和分解细胞膜，从而使细胞溶质（包括各种RNA、蛋白质）释放到细胞外环境中，同时疏水/亲水膜脂自动重组，随机包装周围的RNA 和蛋白质，形成NVs[6]。已有研究证明，超声处理的干细胞破碎液包含NVs，可以促进成纤维细胞增殖和迁移[6]。但是，干细胞破碎液中除了NVs 外，还包含有各种细胞内物质，如蛋白质、脂质、核酸、糖类、酶、激素、维生素、氨基酸等小分子，为了排除这些物质对NVs 特性的影响，项目组采用超声破碎干细胞的方法制备NVs，根据传统外泌体超速离心提取技术纯化NVs，并对NVs 的形态、免疫表型、生物学活性进行分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

PBS 和DMEM/High Glucose 培养基，美国HyClone公司；α-MEM 培养基和胰蛋白酶-EDTA（0.25%），美国Gibco 公司；100×青霉素-链霉素，以色列BI公司；胎牛血清（FBS），澳大利亚Bovogen Biological 公司；重组Anti-TSG101 抗体（ab125011），英国Abcam公司；抗GAPDH 兔多克隆抗体和山羊抗兔IgG H&L（HRP），康为世纪生物科技有限公司；BCA 检测试剂盒（增强型）、RIPA 蛋白裂解液（强）、PMSF 蛋白酶抑制剂、Western Blot 试剂盒、亲水PVDF 膜、极超敏ECL 化学发光试剂和增强型CCK-8 试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。

Countess Ⅱ细胞计数仪，美国Invitrogen 公司；JY92-IIDN 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；L-90K 超速离心机，美国Beckman Optima公司；Tecnai 12 透射电子显微镜，荷兰Philips 公司；Amersham Imager 600UV 多功能成像仪，美国GE 公司。

1.2 hUC-MSCs 培养

人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）使用α-MEM培养基（包含10% FBS 和1%青霉素-链霉素）进行培养。将hUC-MSCs 按照5 000 cells/cm2密度接种于T175 培养瓶中，在37 ℃、5% CO2下培养，直到细胞达到90%～95%汇合度。使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）对hUC-MSCs进行消化，最终在PBS溶液中重悬细胞，并使用细胞计数仪检测细胞数量和活力。

1.3 EVs 的制备

将80%汇合度的hUC-MSCs在无血清的α-MEM培养基中饥饿培养48 h。收集细胞培养上清液，以300×g离心10 min，16 500×g离心20 min，再用0.22 μm过滤器过滤上清。然后，在4 ℃条件下100 000×g 离心2 h，弃除上清液，用PBS 重悬EVs 颗粒，-80 ℃保存备用。

1.4 NVs 的制备

参考WANG 等[6]研究方法，经过改进后制备NVs，将1 mL 1.0×107hUC-MSCs 悬液转移到4 mL EP 管，置于冰水混合物，实施超声破碎。超声条件：变幅杆型号φ3，超声仪探头置于液面下1 cm，功率900 W×40%，超声2 s，关闭2 s，总超声时间4 min，保护温度25 ℃。在4 ℃条件下，细胞破碎液300×g离心5 min，以去除未破碎的细胞，16 500×g 离心20 min，以清除细胞碎片，将上清液通过0.45 μm 过滤器进行过滤，以除去残留的细胞碎片和大粒径囊泡等，获得细胞裂解液（Lysate），在4 ℃条件下，细胞裂解液经100 000×g 超速离心2 h[11]，弃除上清液，用PBS 重悬颗粒，即得NVs，在-80 ℃保存备用。

1.5 NTA 分析粒径

NVs 和EVs 送至上海逍鹏生物科技有限公司进行NTA 测试。

1.6 TEM 鉴定形态

取20 μL NVs 或EVs 样品滴在Parafilm 封口膜上，然后将Formvar/carbon 载样铜网膜面朝下放在液滴上，室温下静置10 min。用镊子将铜网取出，用吸水纸从铜网侧边吸干多余的样品。然后用2%磷钨酸溶液（pH6.4 ～7.0）负染2 min，将铜网取出，并用吸水纸从铜网侧边吸干液体，最后将铜网放置于红外烘烤灯下干燥10 min，在TEM 下观察囊泡的形态，并拍摄电镜照片。

1.7 Western Blot 检测TSG101

利用BCA 蛋白测定试剂盒确定NVs 或EVs 的蛋白质含量。每孔加样蛋白质25 μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），120 V 电泳60 min，冰水浴中300 mA 电转印2.5 h，将NVs 和EVs 包含的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后，室温下用封闭液封闭PVDF 膜15 min，用洗涤液洗涤3 次，每次10 min，在4 ℃条件下用一抗重组Anti-TSG101 抗体、抗GAPDH 兔多克隆抗体孵育过夜，再用洗涤液洗涤3 次，每次10 min，室温下用二抗山羊抗兔IgG H&L （HRP）孵育2 h，再用洗涤液洗涤3 次，每次10 min。最后利用ECL 化学发光试剂在多功能成像仪中曝光成像。

1.8 NVs 对HSF 增殖的影响

取对数生长期的人皮肤成纤维（HSF）细胞，重悬于含10%FBS、1%青霉素-链霉素和89% DMEM/High Glucose 培养基，以1 800 cell/孔的密度接种于96 孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养48 h。更换含有25 μg/L Lysate、NVs 或EVs 的低血清培养基（1%FBS、99% DMEM/High Glucose），37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养48 h。加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养3 h 后，在450 nm 测定吸光度。按照公式（1）计算细胞增殖率。

1.9 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行数据处理，实验均重复3 次，实验数据用均数±标准差（x—±s）表示，P＜0.05表示有统计学差异。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 粒径

NTA 技术是利用光散射和布朗运动的特性获得液体悬浮液中的样本粒度分布，检测结果显示（图1），NVs粒径集中在100 nm左右，NVs粒径（103.5±9.0）nm，EVs 粒径（138.0±0.7）nm，在统计学上无显著差异（P＞0.05），符合一般外泌体的直径大小。

图1 EVs 和NVs 的粒度分布

2.2 表面形态

NVs 和EVs 在TEM 下均观察到100 nm 左右、呈杯垫状圆形或椭圆形的膜型小囊泡，囊泡外周可见膜型结构，与外泌体的经典形态相似，见图2。

图2 EVs 和NVs 在TEM 下的形态

2.3 蛋白质表达

采用Western Blot 分析相同总蛋白量下EVs 和NVs 中TSG101 的表达量，结果如图3 所示。从图中可以看出，NVs 包含的外泌体特征蛋白TSG101 含量远远低于EVs，这可能是组成NVs的膜主要是细胞膜，且在NVs 形成过程中随机包裹的游离TSG101 蛋白总量也较少，导致了NVs 中检测到的TSG 的含量低于EVs。

图3 EVs 和NVs 中TSG101 表达结果

2.4 对成纤维细胞增殖的影响

如图4 所示，超声破碎hUC-MSCs 获得的细胞裂解液、EVs 都能促进HSF 细胞的增殖，与对照组（PBS）相比均具有显著性差异（P＜0.01），且细胞裂解液对HSF 的促增殖效果优于EVs（P＜0.05）；而NVs对HSF 细胞的增殖没有促进作用，细胞增殖情况与对照组（PBS）相似。

图4 EVs 和NVs 对HSF 细胞增殖的影响

3 结论与讨论

脐带间充质干细胞被广泛用于临床研究，可治疗多种疾病，其强大的治疗效果与细胞因子的分泌、细胞外囊泡通信等相关[1]。在细胞外囊泡中，外泌体粒径大小为30～150 μm，具有典型的茶托或杯状结构，表达四跨膜蛋白分化簇（Clusters of Differentiation，CD），包括CD63、CD9 和CD81，此外还包含多泡体（Multivesicular Bodies，MVBs）合成相关的蛋白Alix 和TSG101 等[10]。外泌体还携带功能性mRNAs和miRNAs，可在细胞之间转移[10]。有研究表明，脐带间充质干细胞来源的外泌体富含一组microRNA（miR-21、-23a、-125b 和-145），通过抑制TGF-β2（转化生长因子-β2，Transforming Growth Factor-β2）/SMAD2（Sam 和Mad 相关蛋白2，Sma- and Mad-related protein 2）通路来抑制肌成纤维细胞形成和瘢痕形成[11]。EVs 疗法作为一种新型“无细胞”治疗产品具有广阔前景，但在其临床应用之前仍有许多挑战需要克服，主要为如何进行大规模、快速、低成本生产[4]。利用超声从hUC-MSC 制备工程化纳米囊泡（NVs）可能成为一种高效、快速、大量地生产囊泡的方法，该工程化NVs 与细胞分泌的EVs 的功能是否有差异，成为生产应用前必须了解的重要问题。

本文研究了NVs 的粒径、形态、蛋白质表达等方面，并探讨了NVs 对成纤维细胞增殖的影响。hUCMSC 经过超声破碎，100 000×g、2 h 离心，可获得粒径大小集中在100 nm 左右的NVs，与标准EVs 粒径比较无显著差异，电镜下为杯垫状圆形的膜型小囊泡，几乎不表达外泌体特征蛋白TSG101，对HSF 细胞的增殖没有促进作用。这种NVs与EVs差异的形成，可能反映在NVs 形成的原理与EVs 不同。即EVs 是细胞外泌的一种囊泡，内含特定的蛋白质、脂质和核酸，具有特定的生物学活性[1]；而工程化NVs 是在细胞膜分解后，随机包裹周围的核酸和蛋白质等形成的囊泡，包裹的成分容易受到环境中内容物的浓度、种类等影响，且组成囊泡的磷脂双分子层中蛋白质等成分也是随机的，因此，其形成的囊泡功能也相对会受到影响。

综上所述，本研究旨在探索来源于hUC-MSCs 的工程化NVs 的制备和鉴定方法。通过特征分析，成功建立了一套制备和纯化工程化NVs 的方法，并发现从hUC-MSCs 中获得的NVs 在形态上与细胞分泌的EVs 相似，但在功能上存在区别。为将NVs 应用于临床治疗中，有必要引入靶向分子和功能成分，以实现特定的治疗效果。