乙酰胆碱酯酶检测方法研究进展

焦雯，周文清，章文，许贯虹

（南京医科大学 药学院，江苏南京211166）

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）具有羧肽酶和氨基肽酶的活性，可以降解神经递质乙酰胆碱，减弱乙酰胆碱对突触后膜的作用。AChE 在神经系统学习记忆相关活动中起关键作用，其功能异常可导致神经退行性疾病的发生发展[1]。建立高选择性与高灵敏度的AChE 检测方法有助于深入理解相关生命活动，为相关疾病的药物研发提供有力支持。迄今为止，研究者已经报道了包括比色法、荧光法、电化学法在内的一系列检测方法，其中尤以比色法和荧光法备受关注。本文将重点综述上述方法，并对其发展趋势予以展望。

1 比色法

1.1 Ellman 法

Ellman 法是测定AChE 的传统方法，其基本原理是：乙酰胆碱酯酶水解底物乙酰胆碱产生硫代胆碱，与二硫代二硝基苯甲酸直接反应，生成黄色产物5-硫代2-硝基苯甲酸，可观察其特征吸收峰以确定浓度。Ellman 法操作简单、成本低廉、分析快速，在诸如AChE 检测、抑制剂筛选等研究中得到了广泛应用[2]。

1.2 基于TMB 的比色法

在类过氧化物纳米酶的催化下，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）可被氧化为蓝色oxTMB，是一种常见比色体系。ZHANG 等[3]构建了Ag+/金纳米粒（AuNPs）/十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）类过氧化物纳米酶，并基于该体系实现了AChE 的高灵敏检测。LI 等[4]构建了普鲁士蓝纳米粒/共价有机骨架/AuNPs 复合纳米材料，该材料具有优异的类过氧化物酶活性，在体系存在乙酰硫代胆碱时，AChE 与其反应生成硫代胆碱并干扰纳米酶活性，进而实现对AChE 的测量，该方法具有高度的特异性和高灵敏度。上述体系通常需要过氧化氢参与反应，增加了操作步骤。NI 等[5]另辟蹊径，开发出了基于银离子和乙酰硫代胆碱碘化物的AChE 检测系统，利用其降解产物硫代胆碱与银离子的反应减少oxTMB 生成实现了AChE 的检测，该体系无需制备纳米材料，为AChE 的比色检测提供了新思路。

2 荧光法

荧光分析法具有优异的生物相容性、高特异性和高灵敏度，是研究生物分子特性的理想工具。荧光法测定AChE 可分为荧光增强和荧光猝灭两大类，通过观测荧光信号turn on/off 实现对AChE 含量的监测。

2.1 基于turn on 的方法

2.1.1 贵金属纳米探针

AChE 对乙酰硫代胆碱（ATCh）的水解具有高催化活性，可在数秒内生成大量硫代胆碱（TCh）。张楠等[6]利用聚T 单链DNA 为模板合成了荧光铜纳米粒子，通过TCh 与铜离子的络合实现对AChE 活性的检测和抑制剂的筛选。ZHANG 等[7]利用低荧光谷胱甘肽包封金纳米团簇（GSH-AuNCs），建立了一种直接荧光启动法，AChE 水解S-乙酰基硫代胆碱碘化物（ATCI）得到TCh，水解产物可通过形成Au-S 键增强GSH-AuNCs 的荧光。在抑制剂存在的条件下，AChE 活性被抑制，荧光增强减弱。

2.1.2 双光子荧光探针

相比单光子荧光成像，双光子荧光成像技术组织穿透更深，背景干扰更低，更适用于活体成像。WANG 等[8]设计了一种双光子荧光探针用于原位检测小鼠大脑中的AChE 活性，该探针在800 nm 处通过双光子激发，在560 nm 处发出明亮的荧光，具有极高的灵敏度和良好的选择性。

2.1.3 近红外荧光探针

传统荧光探针受生物体背景荧光干扰，不利于组织成像。近红外探针利用其较大的Stokes 位移可以实现深层组织穿透成像，具有更好的生物成像能力，光毒性也更低。FORTIBUI 等[9]使用BODIPY 染料作为荧光发射基团，与AChE 结合时仅显示微弱荧光，但当体系中存在氨基甲酸二甲酯基团时，活性结合位点丝氨酸失活，使BODIPY 转为游离态，荧光增强。

2.1.4 金属有机骨架探针

金属有机骨架因比表面积大、生物相容性好等优点成为新型纳米酶的理想候选材料。H39GFP 是一种绿色荧光蛋白变体，主序列中含有39 个组氨酸残基。LEI 等[10]基于H39GFP 独特的多价金属离子结合特性和Cu2+的电子转移荧光猝灭效应，研制了一种无标记Cu2+荧光传感器，可在5 min 内快速检测出Cu2+。以ATCh 为底物，进一步将该H39GFP/Cu2+配合物基传感器应用于AChE 活性的turn on 荧光检测。

2.1.5 硅量子点探针

SONG 等[11]采用硅量子点（Silicon Quantum Dots，Si-QDs）作为荧光振子，纳米氧化铁作为猝灭剂，测定AChE。在AChE 及其底物ATCh 存在下，FeOOH被酶解物TCh 分解，恢复Si-QDs 的荧光。特别的是，AChE 传感的灵敏度与FeOOH 的晶体形态密切相关，采用α 型FeOOH 作为猝灭剂时灵敏度最高。

2.2 基于turn off的方法

2.2.1 金纳米团簇

MATHEW 等[12]利用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）包覆金纳米团簇开发了一种高选择性AChE 荧光检测探针（AuQC@BSA）。AuQC@BSA 与AChE 结合后形成AuQC@BSA-AChE 复合物，AChE可以将ACh 水解为胆碱，进而与AuQC@BSA-AChE相互作用并猝灭其荧光，最终实现目标物检测。

2.2.2 比率荧光探针

为改善单一荧光信号测定易受探针浓度、检测仪器和操作误差以及环境因素干扰的不足，XU 等[13]研制了一种基于碳点（Carbon Dots，CDs）的比率荧光探针。当体系中的邻苯二胺（OPD）被Cu2+氧化时，产物可有效猝灭CDs 蓝色荧光，并在570 nm 处产生一个新的发射峰，形成一对比率荧光体系。AChE催化乙酰硫胆碱水解生成硫代胆碱，其巯基可捕获Cu2+，抑制OPD 氧化，降低了CDs 被猝灭的程度。该探针对AChE 检测限为0.10 U/L。

MnO2纳米片因比表面积大、生物相容性好、氧化还原性能好、吸收带宽（300 ～600 nm）、具过氧化物酶样活性等特点常被应用于荧光检测体系。YE 等[14]利用石墨烯量子点（Graphene Quantum Dots，GQDs）和OPD，设计了一种高灵敏度、高选择性检测AChE的比率荧光探针。GQDs 具有强荧光，由于MnO2纳米片的吸收光谱与GQDs 的激发光谱和发射光谱之间有广泛重叠，GQDs 在450 nm 处的荧光被内滤效应有效猝灭。同时，由于MnO2纳米片的过氧化物酶样活性，OPD 被催化氧化为黄色荧光物质2,3-二氨基酚嗪（oxOPD），在572 nm 处有一个新的发射峰，以荧光强度比F450/F572 作为信号输出，可建立比率荧光法检测AChE 活性。

表1 比色法与荧光法的比较

3 结语

作为AChE 最常见的两种含量检测方法，比色法和荧光法各有优势，一般而言荧光法的检测限较低，线性范围较广，而比色法的操作更简便，检测成本更低。尽管如此，现有AChE 检测方法的灵敏度仍有待提高，选择性也亟待改善，且大都需要特定检测设备。如何发展出高效率低成本的快速检测方法，仍然是乙酰胆碱酯酶测定方法优化的主要方向。