凤仙花提取物对灰指甲主要致病菌的抑制作用

刘梦雅，罗林焱，孙志彬，胡晓倩，李有鹏，胡焕焕，姬国杰

（1.新乡医学院三全学院 生命科学技术学院，河南新乡 453000；2.新乡医学院三全学院 干细胞研究院，河南新乡 453000；3.新乡医学院三全学院 生物与基础医学实验教学中心，河南新乡 453000）

甲真菌病是指（趾）甲的真菌病，导致患者指甲板变色和增厚，是全世界最常见的指（趾）甲感染。引起灰指甲的致病菌主要有白色念珠菌和红色毛癣菌等。白色念珠菌是定植于人体皮肤表面及开放性腔道（口腔、消化道及泌尿生殖道）的共生菌群，在一定条件下可引起局部上皮甚至全身感染[1-2]。红色毛癣菌是一种常见的亲人性致病性皮肤癣菌[3]，有研究指出皮肤癣菌病中90%的慢性感染都由其所致[4]。目前，针对甲真菌病的治疗方法主要有口服抗真菌药物、局部药物和激光等，但口服抗真菌药物副作用较大[5]；依非那康唑、塔瓦博洛等局部治疗药物治愈率普遍较低，治疗周期长；激光有助于改善指（趾）甲外观。同时，由于治疗的研究方法和定义的高度变化性，以上方法对甲真菌病的有效性尚未得到充分证明[6]。因此，迫切需要高效、副作用低的新型药物。

中草药已成为开发抗真菌药物的一个重要材料[7-9]。凤仙花不仅是观赏花卉，而且还是一种中草药[10]。我国中医学研究表明，凤仙花在抑制真菌方面有较好的效果，可以抗感染、镇痛、抗炎等[11]，也经常被用于治疗蛇咬伤、鹅掌风、痈疖疮疔、灰指甲等病症[12]，化学成分主要有黄酮、萘醌、花青素等[13]。目前，国内外主要研究凤仙花的化学成分，其中萘醌类具有明显的抑菌活性[14]，但其抑菌机制不详，同时也缺少对凤仙花资源的开发与应用。

凤仙花对白色念珠菌和红色毛癣菌治疗疗效显著，因其价格低廉、来源广泛等优点，在临床上具有一定的研究价值。本文首先对凤仙花的有效成分进行提取和富集，并探讨其体外抑菌活性，在此基础上对抑菌机制进行初步研究，为开发新型中药抑菌药物提供理论基础，同时为治疗灰指甲等皮肤疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LS-75HJ 立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；TS-300DC 恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；SW-CJ-2F 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；U/V110Pro紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；JY10002 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GT16-3 高速台式离心机，北京新时代北利医疗器械有限公司；DHP-600 电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司。

重瓣凤仙花（ImpatiensbalsaminaL.）采集于河南省开封市；碱性磷酸酶（AKP）试剂盒、马铃薯葡萄糖琼脂营养培养基（PDA）、酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPD），北京索莱宝科技有限公司；伊曲康唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；95%乙醇，国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜（DMSO），天津市德恩化学试剂有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司。

白色念珠菌（GDMCC3.629）、红色毛癣菌（ATCC MYA4438），广东微生物菌种保藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 凤仙花醇提取液的制备

参照董晨虹[15]的方法并加以改进。称取凤仙花的茎、叶、花各1.5 g，用研钵碾碎，加入200 mL 55%乙醇，置于索氏提取器中70 ℃抽提2 h，按上述条件重复提取1 次，真空抽滤，得到澄清的提取液，60 ℃减压浓缩至4.5 mL，得到凤仙花浓缩液（1 g/mL），0.22 μm 针头滤器过滤，放入冰箱冷藏，备用。

1.2.2 阳性对照的制备

称取2.5 mg 伊曲康唑粉剂溶于177 μL DMSO 溶液中，配置成浓度为20 mmol/L 储备液，取10 μL 储备液，用4 990 μL 无菌水稀释为40 μmol/L 工作液，将储备液与工作液密封，于-20 ℃避光保存[16]。

1.2.3 菌悬液的制备

将白色念珠菌、红色毛癣菌冻干粉全部溶解，分别转移至YPD、PDA 固体培养基上，白色念珠菌在28 ℃培养箱中培养2 d，红色毛癣菌在30 ℃培养箱中培养7 d，连续接种传代两次恢复活力。将已活化的菌株转移至液体培养基中按上述温度、150 r/min 振荡培养，使菌悬液的浓度达到2×106CFU/mL，备用[17]。

1.2.4 生长动力学曲线的测定

（1）白色念珠菌生长动力学曲线的测定

参考董洁洁[18]的方法并加以改进。白色念珠菌接种至100 mL YPD 液体培养基中，于150 r/min、28 ℃培养箱中培养12 h。将2 mL 菌悬液接种于200 mL液体YPD 培养基中振荡培养，分别在0 ～14 h 和26 ～36 h 每隔2 h 测定菌悬液在530 nm 的吸光度OD530，分别以时间、OD值为横、纵坐标，绘制白色念珠菌生长动力学曲线图。

（2）红色毛癣菌生长动力学曲线的测定

参考鲍迎秋等[19]的方法，将已接种红色毛癣菌的PDA 固体培养基于30 ℃条件下培养2 周，用解剖显微镜观察菌落形态并用游标卡尺测量记录菌落直径，分别以生长时间、菌落平均直径为横、纵坐标绘成红色毛癣菌生长动力学曲线。

1.2.5 最低抑菌浓度（MIC）的测定

测定白色念珠菌的MIC，用醇提法得到浓度为0.5 g/mL 的凤仙花提取液母液，用二倍稀释法进行稀释，得到质量浓度分别为0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL、0.062 5 g/mL 的提取液；测定红色毛癣菌的MIC，用相同方法得到浓度为1 g/mL 的凤仙花提取液母液，用二倍稀释法进行稀释，得到质量浓度分别为1.000 00 g/mL、0.500 00 g/mL、0.250 00 g/mL、0.125 00 g/mL、0.062 50 g/mL、0.031 25 g/mL、0.015 60 g/mL的提取液。

在超净工作台内，将无菌牛津杯放入培养皿，待培养基凝固后取出牛津杯及里面的培养基，形成一圆柱形小孔，分别取白色念珠菌、红色毛癣菌菌悬液200 μL 在固体琼脂平板上均匀涂布，在牛津杯孔内分别加入100 μL 不同浓度的凤仙花稀释液，伊曲康唑工作液为阳性对照组，无菌水为阴性对照组，每个浓度做3 个重复处理。最后将白色念珠菌置于28 ℃条件下培养24 h，红色毛癣菌置于30 ℃条件下培养5 d，抑菌圈边缘处的凤仙花提取液的浓度可视为其对指示菌的最低抑菌浓度（MIC），即能产生透明抑菌圈的最低抑菌剂浓度定为MIC。观察抑菌圈大小，拍照并用游标卡尺测量其直径大小，取平均值。

1.2.6 凤仙花醇提取液对两种菌细胞壁的影响

参照碱性磷酸酶试剂盒说明书及董洁洁[18]的方法并加以改进。50 mL 液体YPD、PDA 培养基中接种白色念珠菌（红色毛癣菌），在28 ℃（30 ℃）培养箱中150 r/min 培养12 h（7 d）作为预备菌悬液，在预备菌悬液中加入最低抑菌浓度的凤仙花醇提取液。在白色念珠菌生长0 h、2 h、4 h、6 h 和8 h 时取样，红色毛癣菌生长0 d、1.0 d、1.5 d、2.0 d、2.5 d、3.0 d、4.0 d、5.0 d、6.0 d 和7.0 d 时取样，10 000 r/min 离心取上清，即为待测样品，测定标准管、空白管、测定管、对照管在510 nm 处的OD510值，按照公式（1）计算AKP 活性（U/mL）。

1.2.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行统计学处理，抑菌圈直径以均值±标准差表示，抑菌圈直径组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 生长动力学曲线

2.1.1 白色念珠菌生长动力学曲线

如图1 所示，白色念珠菌在接种后至4 ～12 h 处于对数生长期，生长速度较快，在12 ～18 h 处于稳定期，随后进入衰退期。

图1 白色念珠菌生长动力学曲线

2.1.2 红色毛癣菌生长动力学曲线

如图2 所示，红色毛癣菌3 ～12 d 处于对数生长期，生长速度较快，12 d 后进入稳定期。

图2 红色毛癣菌生长动力学曲线

2.2 凤仙花醇提取液对两种菌的抑制作用

由图3 和图4 可知，与阴性对照相比，凤仙花醇提取液的浓度为0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL时，抑菌圈直径较大，说明此浓度对白色念珠菌有明显抑制作用（P＜0.05），且具浓度依赖性；0.062 5 g/mL凤仙花醇提取液对白色念珠菌的抑制效果无显著性差异（P＞0.05），即无抑制作用，抑菌圈直径为0。由此可知最小抑菌浓度是0.125 0 g/mL。与阳性对照相比，凤仙花提取液浓度为0.500 0 g/mL 时，抑菌效果显著提高（P＜0.05）。

图3 不同浓度梯度凤仙花醇提取液对白色念珠菌抑制效果

图4 不同浓度梯度凤仙花醇提取液对白色念珠菌的抑菌圈

由图5 和图6 可知，凤仙花醇提取液的浓度为不低于0.250 00 g/mL 时，平板上没有菌落出现，说明此浓度对红色毛癣菌完全抑制。与阴性对照相比，0.031 25 g/mL、0.062 50 g/mL、0.125 00 g/mL 凤仙花提取液对红色毛癣菌有显著的抑制作用（P＜0.05），且具有浓度依赖性；0.015 60 g/mL 凤仙花提取液无显著抑制作用（P＞0.05）。由此可知凤仙花醇提取液对红色毛癣菌的最低抑菌浓度为0.031 25 g/mL。与阳性对照相比，凤仙花醇提取液浓度大于0.062 50 g/mL时，具有显著抑菌效果（P＜0.05）。

图5 不同浓度梯度凤仙花醇提取液对红色毛癣菌抑制效果

图6 不同浓度梯度凤仙花醇提取液对红色毛癣菌的抑菌圈

综上可知，在一定浓度范围内，随着提取液浓度的增加，抑菌圈直径在增加，说明抑制作用在不断增强。凤仙花醇提取液对两种供试菌都有明显的抑制作用，对红色毛癣菌的抑制效果较白色念珠菌更显著，可知不同真菌对同一凤仙花醇提取液的敏感程度也不同。

2.3 凤仙花醇提取液对两种菌细胞壁的影响

如图7 所示，在0 ～2 h 时，白色念珠菌菌悬液上清在510 nm 下的吸光度增加速率较慢，表明由于作用时间较短，凤仙花醇提取液未对白色念珠菌细胞壁产生明显破坏作用；在2 ～8 h 内吸光度增加速率明显提升，表明可以在菌体体外检测到AKP 活性，证明凤仙花醇提取液影响了菌体细胞壁的通透性。

图7 凤仙花提取物对白色念珠菌细胞壁的影响

如图8 所示，在0 ～2.5 d 内，红色毛癣菌菌悬液上清在510 nm 下的吸光度增加速率较快，随后吸光度基本保持稳定，表明可以在菌体外部检测到AKP活性，证明凤仙花醇提取液影响了菌体细胞壁的通透性。

图8 凤仙花提取物对红色毛癣菌细胞壁的影响

3 结论与讨论

用牛津杯法对凤仙花醇提取液的抑菌效果进行研究，结果表明，凤仙花醇提取液对白色念珠菌和红色毛癣菌具有良好的抑制效果，且浓度越高，抑制效果越显著，最小抑菌浓度分别为0.125 0 g/mL、0.031 25 g/mL，对红色毛癣菌的抑制效果更显著。通过本文的抑菌机制实验，表明凤仙花提取物通过破坏真菌的细胞壁完整性，改变细胞壁的通透性抑制真菌的活性，与文献结果一致[20-21]。因此，研究植物提取物的抗菌潜力和实际无毒性表明，通过对植物的进一步研究，利用其开发抗菌药物是可行的[22]。

与其他植物的临床应用数据相比，凤仙花的活血、止痛等作用机制和相应的物质基础，以及其他部位如根和种子的研究较少，因此仍有大量关于凤仙花不同药用部位的研究工作需要开展[23]。降低抗真菌药物毒副作用、改善耐药性和开发广谱、耐药、有效的新药物是抗真菌药物研究的主题[23]。本实验为研究中草药新型抗菌药物提供了理论支持，因样本来源单一，抑菌机理研究还不够完整，本实验研究有一定的局限性。