赤桉蜂蜜抗炎作用的初步研究

王凡乐，林韦康，陶春霖

（王叔和（郑州）生物制药工程有限公司，河南郑州 450000）

蜂蜜具有多种功能活性和丰富的营养价值，广泛应用于食品加工及医药产业中。《神农本草经》中称“蜂蜜味甘、平，安五脏诸不足，益气补中，止痛”，明确指出了蜂蜜的功效[1]。近代研究表明，蜂蜜具有抗菌、抗炎、抗氧化[2]、促进伤口愈合等功能，这些都归因于其含有的特殊活性物质[3]，蜂蜜中主要包含糖和水，其次还含有少量蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质以及一些多酚、萜烯、生物碱等。近年关于蜂蜜在临床上抗炎活性的相关报道屡见不鲜，而其中功效最为突出的是赤桉蜂蜜。赤桉蜂蜜产自澳大利亚原始森林，其活性指数（Total Activity，TA）高达30，有丰富的药用价值和强大的抑菌能力，对幽门螺杆菌的杀灭特性已在国内外很多地方运用，并被医生推荐给胃溃疡和胃癌患者。

炎症是导致伤口疼痛和水肿的主要原因。蜂蜜有抗炎活性[4]，可以减轻临床试验、细胞实验及动物模型中的炎症反应。蜂蜜中的酚类可提高人体内超氧化物歧化酶（SOD）和NO 的水平，抑制诱导白细胞介素-6（IL-6）、α 肿瘤坏死因子（TNF-α）和IL-1β 的表达[5]。ALMASAUDI 等[6]研究表明，蜂蜜可使胃溃疡大鼠模型胃黏膜中SOD 的水平显著升高，血浆中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平下降[7]。本研究拟选用JH 与其他蜂蜜作抗炎对比研究，为JH 的抗炎作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品与细胞系

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，武汉普诺赛生命科技有限公司；TA10 赤桉蜂蜜、TA30 赤桉蜂蜜，洋妆源（北京）网络科技有限公司。

1.2 试剂

DMEM 培养基（批号PM150210）、胎牛血清（批号164210）、PBS 缓冲液（批号PB180327），武汉普诺赛生物科技有限公司；CCK-8 试剂（批号BMU106-CN），亚科因生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO，批号D8371），脂多糖（LPS，批号L8880），北京索莱宝科技有限公司；T25 细胞培养瓶、96 孔细胞培养板，无锡耐思生命科技股份有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α 检测试剂盒，江苏酶免实业有限公司。

1.3 实验仪器

XPR 电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；BIO-RAD680 型酶标仪，美国BIO-RAD 公司；MCO-170 CO2培养箱，冰山松洋生物科技（大连）有限公司；L580R 台式冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；W-CJ-2FD-Ⅱ生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

RAW264.7 细胞复苏后，混悬于含10% FBS 的DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.4.2 CCK-8 法检测蜂蜜对RAW264.7 细胞的毒性

取对数生长期的RAW264.7 细胞，1×104个/孔接种至96 孔板，培养箱过夜孵育。

实验设置空白对照组、LPS 组、Honey 组（TA10赤桉蜂蜜）与JH 组（TA30 赤桉蜂蜜），每组平行3 孔。Honey 组与JH 组分别设置7 个浓度梯度（5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL和320 μg/mL），称取两种蜂蜜各10 mg，加入完全培养基配制成1 mg/mL，再稀释成所需浓度；空白对照组加入200 μL 完全培养基；LPS 组加入等量含1 mg/L LPS 的完全培养基。给药培养24 h 后，弃掉上清液，每孔加100 μL 的10% CCK-8，37 ℃避光孵育4 h，于450 nm 处测量OD值。根据公式（1）计算细胞存活率。

1.4.3 细胞给药及脂LPS 诱导

将细胞以5×104个/孔接种至24 孔板，分为空白对照组、LPS 组、Honey 组及JH 组。参考2.2 实验结果，选取细胞活力拐点附近浓度，确定给药时间为24 h，每组3 个复孔。

待细胞铺板率达到60%，吸弃上清，每孔加2 mL PBS 清洗3 次，1 mL/孔分组给药。继续培养6 h 后，弃去上清，PBS 清洗2 次，除空白组外各组加入1 mg/L的LPS；空白对照组不进行任何处理。培养24 h 后收集上清，4 ℃离心20 min（2 500 r/min），收集各组细胞上清至无菌离心管中，于-20 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.4.4 ELISA 测定IL-6、IL-1β 和TNF-α 浓度

取1.4.3 项下收集的上清，使用试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量。按照说明书操作，于450 nm 波长处测其OD值，计算各组浓度。

1.5 数据统计分析

实验数据至少重复3 次，结果以Means±SEM 表示。数据采用Graphpad 软件分析，统计结果P＜0.05认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 JH 对RAW264.7 细胞活力的影响

由图1 可知，Honey 组在40 μg/mL 时RAW264.7细胞存活率最高；JH 组随着浓度增大，细胞存活率呈先增大后减小的趋势，但均高于同浓度下Honey 组细胞存活率。给药24 h 后，JH 浓度为20 μg/mL 和40 μg/mL 时，细胞存活率均大于80%。一般来说，细胞存活率大于80%可认为药物对细胞没有毒性，即对LPS 诱导的细胞抗炎损伤有一定的保护作用。综合考虑，选用药物浓度40 μg/mL 进行后续实验。

2.2 JH 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞分泌炎症因子的影响

由图2 可知，与空白对照组相比，LPS 组中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌水平显著增加（P＜0.01），说明炎症细胞模型构建成功。与LPS 组比较，JH 组的TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌水平均显著降低（P＜0.01），Honey 组TNF-α、IL-6 和IL-1β分泌水平均明显降低（P＜0.01）。表明JH 对LPS诱导的RAW264.7 炎症损伤有一定的保护作用。

图2 JH 对LPS 刺激RAW264.7 分泌炎症因子的影响

3 讨论与结论

RAW264.7 是一种单核巨噬细胞，当巨噬细胞受到炎症刺激时能迅速被活化，识别并清除体内异物，并同时分泌多种生物活性物质。LPS 能导致发热、炎症及休克，又称作内毒素[8]。LPS 诱导刺激巨噬细胞释放炎症介质和炎性因子参与机体的急性免疫应答，从而引起炎症损伤[9]。TNF-α 是一种促炎性蛋白，当巨噬细胞受到促炎因子的刺激后合成和释放[10]。IL-6 是T 细胞经活化后分泌的一种免疫调节因子，与TNF-α 共同参与调节炎症反应，是反映机体炎症程度的重要指标[11]。IL-1β 是由巨噬细胞分泌，可加重炎症反应的因子。这些炎症因子的大量分泌可引起机体全身性的炎症反应。本研究采用LPS 诱导建立RAW264.7 细胞炎症损伤模型，评价JH 对LPS 诱导的皮肤细胞损伤后的保护作用。结果表明，经LPS诱导后，RAW264.7 释放的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 明显增多，说明炎症细胞模型构建成功；与LPS 组相比，经40 μg/mL JH 处理后细胞活力均有显著升高，炎性因子含量均有所下降，且保护效果明显优于同浓度下Honey 组。由此推测JH 对LPS 诱导的皮肤炎症有良好的抗炎效果。

综上所述，JH 可有效抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 的分泌，从而达到抗炎的作用。与Honey 组相比，JH 能更有效地降低LPS 诱导损伤的细胞中炎症因子的含量，缓解炎症刺激，提高细胞存活率。本研究为蜂蜜保护皮肤、抗炎刺激的化妆品领域提供了一定的理论依据，为抗炎成分提供了替代可能性。