不同品种芦荟中芦荟苷的抗氧化活性研究

曾小彤，石丽平,2，陶洪坤,3，林劲松，王怡，魏伟

（1.四川文理学院，四川达州 635000；2.西南医科大学，四川泸州 646099；3.成都大学，四川成都 610106）

芦荟是一种多年生百合科草本植物，富含多种活性物质，在医疗、美容、食品等领域应用广泛[1]。芦荟苷是芦荟中蒽醌类化合物的代表活性成分之一，具有抗氧化、抗菌等作用[2]。常见的药食两用芦荟有库拉索芦荟、中华芦荟、木立芦荟等，芦荟因其品种不同，有效成分和含量可能存在差异[3]。陈丹等[4]采用电子自旋共振法检测芦荟苷清除超氧阴离子自由基的能力，发现芦荟苷具有良好的清除超氧阴离子自由基的作用。本研究采用超声波法提取芦荟苷，并对其抗氧化活性进行评价，为芦荟作为药用植物资源的进一步开发与研究提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜库拉索芦荟、新鲜中华芦荟、新鲜木立芦荟，网购；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS，98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH，98%）、芦荟苷标准品（95%），上海源叶生物科技有限公司；1,2-二硝基苯（98%），阿达马斯试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

将3 种新鲜芦荟叶片洗净剪碎，冷冻干燥，研磨成粉末，过100 目筛，密封并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 芦荟苷提取液制备

超声波提取制备芦荟苷提取液参考吉慧杰等[5]的方法，并做了适当修改。称取3 种样品各1 g，以95%乙醇为提取剂，按1 ∶30（g ∶mL）的料液比，于35 ℃超声提取30 min。提取两次，合并上清液，浓缩，置于50 mL 容量瓶中用乙醇定容至刻度线，得到芦荟苷提取液[中华芦荟芦荟苷提取液（ALZs）、木立芦荟芦荟苷提取液（ALMs）、库拉索芦荟芦荟苷提取液（ALKs）]。

1.3.3 芦荟苷含量测定方法

芦荟苷标准曲线的绘制参考吉慧杰等[5]的方法。精密称取芦荟苷标准品2 mg，以95%乙醇为溶剂，配制成0.02 mg/mL 的标准溶液。分别移取芦荟苷标准溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL 定容于10 mL 容量瓶中，混合均匀，稀释为0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL、0.006 mg/mL、0.007 mg/mL、0.008 mg/mL、0.009 mg/mL、0.010 mg/mL。分别移取ALZs、ALKs 和ALMs 1 mL 于25 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度线，摇匀，静置，于360 nm 处测定吸光度。以芦荟苷溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（回归方程为Y=47.588X+0.000 9，相关系数R2=0.999 7），并根据芦荟苷标准曲线方程计算3种芦荟中芦荟苷的含量。

1.3.4 芦荟苷提取液的抗氧化活性评价

综上所述，孕中期GDM患者容易发生严重的糖脂代谢异常，并且血浆纤维蛋白原水平明显升高可能会加重患者糖脂异常，同时患者BMI、空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白-胆固醇是影响纤维蛋白原的独立危险因素，这亦提示检测血浆纤维蛋白原水平对评估孕中期GDM疾病发生与发展具有重要的预测价值。

（1）DPPH 自由基清除率的测定

DPPH 自由基清除率的测定方法参考文献[6]。各取2 mL 不同质量浓度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的样品溶液，快速加入2 mL预处理好的DPPH乙醇溶液（质量分数为0.004%）。混合均匀，在室温下避光静置30 min，在517 nm 处检测混合液的吸光度。等质量浓度Vc 溶液作为阳性对照品，按照公式（1）计算芦荟苷样品DPPH 自由基清除率。

式中：X为DPPH 自由基清除率，%；A0为等体积乙醇代替样品与DPPH 乙醇溶液的吸光度值；A1为样品与DPPH 乙醇溶液的吸光度值；A2为样品与不含DPPH 的乙醇溶液的吸光度值。

（2）ABTS 自由基清除率的测定

ABTS自由基清除率的测定参考王荣等[7]的方法。精密吸取梯度浓度样品溶液（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）100 μL 和ABTS 自由基水溶液100 μL 作为实验组；以100 μL 95%乙醇代替ABTS 自由基水溶液作为对照组；以加入100 μL ABTS 自由基水溶液和100 μL 95%乙醇为标准组，避光反应30 min，在734 nm 下测定吸光度。等质量浓度Vc 溶液作为阳性对照品，按照公式（2）计算芦荟苷样品ABTS 自由基清除率。

式中：Y为ABTS 自由基清除率，%；B1为实验组的吸光度值；B2为对照组的吸光度；B3为标准组的吸光度。

（3）羟基自由基清除率的测定

羟基自由基清除率的测定参考蒋文明[6]的方法。取不同质量浓度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的样品溶液1 mL，加入1 mmol/L 的硫酸亚铁溶液1 mL、9 mmol/L 的双氧水溶液1 mL 和3 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液1 mL。分别将其混合均匀后，于37 ℃恒温水浴中反应30 min。冷却至室温，在510 nm 波长下测定吸光度。空白对照为1 mL 蒸馏水代替样品溶液，等质量浓度Vc 溶液作为阳性对照品，按照公式（3）计算芦荟苷样品羟基自由基清除率。

式中：Z为羟基自由基清除率，%；C0为空白对照溶液的吸光度值；C1为样品的吸光度值。

（4）还原能力测定

根据YEN 等[8]的研究确定了还原力的测定方法。将不同质量浓度（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL）的样品溶液1 mL加入试管中，再加入2.5 mL 0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6）和2.5 mL 的铁氰化钾溶液（1%）。振荡均匀后，在50 ℃恒温水浴中反应20 min。待反应完成后冷却至室温，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%），0.4 mL 三氯化铁溶液（1%）和4 mL 蒸馏水，静置反应10 min，3 500 r/min 离心5 min，分取上清液，在700 nm 波长下测吸光度。空白对照为1 mL 蒸馏水代替样品溶液，等质量浓度Vc 溶液作为阳性对照品，芦荟苷样品还原能力吸光值=空白组溶液吸光值-样品组吸光值。

2 结果与分析

2.1 芦荟苷含量测定

3 个品种的芦荟苷含量如表1 所示。3 个品种芦荟中芦荟苷含量的大小顺序为ALMs ＞ALZs ＞ALKs，芦荟苷含量最高的为木立芦荟[（9.02±0.0124）mg/g]。

表1 不同品种芦荟中芦荟苷含量

2.2 不同品种芦荟苷抗氧化活性比较

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

不同样品对DPPH 自由基的清除效果如图1 所示。不同浓度的ALZs、ALKs 和ALMs 均对DPPH 自由基有明显的清除作用。在0.2 ～6.4 mg/mL，3 个样品的DPPH 自由基清除率均低于对照品Vc；在1.6 ～3.2 mg/mL，其清除能力大小顺序为ALZs＞ALKs＞ALMs；当浓度为6.4 mg/mL 时，ALZs 和ALMs 的清除能力相当，分别是96.70%和96.27%，略低于VC（99.74%），高于ALKs（90.25%）。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分别是0.05 mg/mL、0.78 mg/mL、1.09 mg/mL 和1.21 mg/mL。综上所述，不同品种芦荟中的芦荟苷对DPPH 自由基的清除作用不同，中华芦荟苷提取物对DPPH 自由基清除存在一定优势。

图1 不同样品的DPPH 自由基清除能力

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

ABTS 法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法，不同样品对ABTS 自由基的清除效果见图2。3 种芦荟苷样品在不同浓度下对ABTS 自由基的清除能力均呈浓度依赖性。在0.4 ～1.6 mg/mL，ALZs 清除ABTS 自由基的能力较强；在1.6 ～3.2 mg/mL，ALMs 清除ABTS 自由基的增速加快；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALZs和ALMs 的清除能力相当。当样品浓度为6.4 mg/mL时，ALMs、ALZs 和ALKs 的清除率分别为94.78%、94.04% 和92.45%。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分别是0.09 mg/mL、0.24 mg/mL、0.25 mg/mL和0.31 mg/mL。总体上看，中华芦荟苷提取物对ABTS自由基清除存在一定优势。

图2 不同样品的ABTS 自由基清除能力

2.2.3 羟基自由基清除能力

羟基自由基能导致邻近生物分子的氧化损伤，因此清除羟基自由基对细胞或食物系统的抗氧化防御具有重要意义。不同样品对羟基自由基的清除效果如图3 所示，不同浓度的样品均对羟基自由基有明显的清除作用，且呈浓度依赖趋势。3 种提取物的羟基自由基清除率均低于VC，在0.2 ～1.6 mg/mL，ALMs、ALKs 的清除能力相当；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALZs 上升趋势较为明显，且ALZs 清除羟基自由基的能力优于ALMs、ALKs；当浓度为6.4 mg/mL 时，ALZs、ALMs 和ALKs 的清除率分别为74.03%、67.96%和63.17%。VC、ALZs、ALKs 和ALMs 的EC50值分别是0.04 mg/mL、1.35 mg/mL、1.70 mg/mL 和1.72 mg/mL。综上，中华芦荟苷提取物在清除羟基自由基方面存在优势。

图3 不同样品的羟基自由基清除能力

2.2.4 还原能力

还原能力法也是一种常见的抗氧化性评价方法，吸光度大小能反映样品的还原能力大小，吸光度越大，还原能力越强，抗氧化性越强。如图4 所示，随着样品浓度的增加，样品的还原能力增强。在0.8 ～1.6 mg/mL，ALZs 还原能力优于ALMs、ALKs，但在高浓度条件下还原能力的增速减慢；在3.2 ～6.4 mg/mL，ALMs 还原能力要优于ALZs、ALKs；当样品浓度为6.4 mg/mL 时，ALMs、ALZs 和ALKs 的吸光值分别是0.08、0.04 和0.02。总体上，不同品种的芦荟苷还原能力存在差异，高浓度情况下，木立芦荟苷提取物的还原能力存在优势。

图4 不同样品的还原能力

3 结论

本文以3 种新鲜芦荟为原料，采用超声提取法制备得到芦荟苷乙醇提取液（ALZs、ALMs、ALKs），并通过对DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羟自由基清除能力以及还原能力的测定评价其抗氧化活性。结果表明，不同品种中芦荟苷的抗氧化活性存在差异，且中华芦荟中芦荟苷在清除DPPH 自由基、ABTS 自由基以及羟基自由基方面存在一定的优势。但根据含量测定与活性评价结果发现，芦荟苷的含量与活性之间未呈现出一定的相关性，例如木立芦荟的芦荟苷含量要高于中华芦荟，但是中华芦荟的DPPH 自由基清除能力和羟基自由基清除能力要明显高于木立芦荟，这可能是因为天然芦荟苷存在两种同分异构体（芦荟苷A 和芦荟苷B），可能还包含其他结构类型的芦荟苷类化合物[9]。而本研究所得芦荟苷为粗提混合物，尚未进行进一步的分离与纯化，缺乏结构与活性的相关性研究，后期将对其进行进一步的分离纯化、结构分析，以期得到结构与活性的关系。