肝细胞癌中7-脱氢胆固醇还原酶表达的临床意义

莫伟嘉，张楚月，韦京妤，张观兰，唐宇星，殷彬烔，黄洁庄，罗嘉嫄，蒋洪棉，陈罡，吴华裕

（1.广西医科大学 第一附属医院病理科，广西南宁 530021；2.广西医科大学 第五附属医院/南宁市第一人民医院病理科，广西南宁 530021；3.广西医科大学 第五附属医院/南宁市第一人民医院医学实验中心，广西南宁 530021）

胆固醇作为构成细胞内各种膜结构的不可或缺的重要物质，对真核生物细胞的生长发育和行为调控具有重要的作用[1]。维持胆固醇在组织细胞内的动态平衡对于细胞正常生长发育极为重要[2]，胆固醇在细胞内失衡可致使疾病的发生，如在肝炎向肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）发展的病理过程中，胆固醇的异常堆积有很大的推动作用[3]。有不少学者从不同的角度，描述了胆固醇对HCC 生物学行为的影响[4-6]。因此，发现胆固醇的潜在调节机制对于降低HCC 的发病风险、改变HCC 的生物学行为、改善HCC 的转归和预后、寻求有效的靶向干预措施等具有重要的临床意义。

在胆固醇的合成过程中，作为关键酶之一，7-脱氢胆固醇还原酶（7-Dehydrocholesterol Reductase，DHCR7）扮演着重要的角色[7-8]。DHCR7 可将维生素D 前体物质转化为胆固醇，以发挥调节胆固醇的作用。同时，有遗传分析研究表明，25-羟维生素D（25-[OH]-D3）血清水平与丙型肝炎病毒（HCV）相关性HCC 具有相关性，而DHCR7 是调节25-[OH]-D3血清水平的决定性因素[9]。有分子机制研究表明，在（基因型2a）HCV 通过人肝癌细胞Huh7 中诱导出的人HCC 中，DHCR7 同时作为中枢基因和中枢节点存在，可能作为一种潜在的生物标志物对日本暴发性肝炎病毒（JFH-1）感染导致的HCC 的发生发展起到重要作用[10]。但如今还未见到探索DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 细胞中表达水平的相关报道，故本研究拟整合基因芯片、RNA 测序以及组织芯片数据，探索DHCR7 在HCC 的表达意义。

1 材料与方法

1.1 临床数据收集

HCC基因芯片及测序数据来自ArrayExpress（https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）、Gene Expression Omnibus（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、Genotype-Tissue Expression（GTEx，https://www.gtexportal.org/home/index.html） 和The Cancer Genome Atlas Program（TCGA，https://www.cancer.gov/ccg/research/genomesequencing/tcga）。纳入的公共队列样本数据须满足以下条件：（1）研究对象为智人；（2）公共队列数据需包含HCC 和正常肝脏组织；（3）样本为组织层次；（4）数据集中须包含DHCR7 的表达数据；（5）公共队列数据样本不受任何物理、化学或其他因素的影响。排除原则为：（1）动物标本；（2）无DHCR7 表达值的数据；（3）重复标本。

1.2 DHCR7 mRNA 在HCC 组织中的表达情况

使用STATA 14.0 软件评估DHCR7 mRNA 的标准化平均差值（Standardized Mean Difference，SMD）。I2为入组研究之间的异质性，I2＞50%或P＜0.05称为高异质性，采用随机效应模型；其余采用固定效应模型。为研究DHCR7 对HCC 组织的鉴别能力，计算总体受试者工作特征曲线（summary Receiver Operating Characteristics，sROC），得到曲线下的总面积（Area Under the Curve，AUC），并计算敏感性和特异性。Egger’s 与Begg’s 检验用于判别合并结果是否具有发表偏倚，P≥0.05 提示结果不具有显著的发表偏倚。

1.3 DHCR7 蛋白在HCC 中的表达水平

利用人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas，THPA）获取DHCR7 蛋白在HCC 和非癌肝组织的表达情况，并进行比较。

2 结果与分析

2.1 DHCR7 在HCC 及非癌肝对照组织中的mRNA表达水平

最终从上述数据库中获得了7 384 份样本，包括3 941 份HCC 样本和3 443 份对照样本。为明确DHCR7 mRNA 在HCC 中的表达水平，整合纳入数据集计算DHCR7 mRNA 表达量的SMD 值。由于I2＞75%且P＜0.01，研究采取随机效应模型，计算得出SMD 为0.35，95%置信区间（95%CI）为0.20 ～0.51（图1）。SMD 结果的Egger’s 检验P值为0.521，Begg’s 检验P值为0.400，均显示P＞0.05，图像也显示了一种对称的形式，即总体上并不存在明显的偏倚（图2）。结果初步显示，DHCR7 mRNA 表达在HCC 中显著增多。

图1 HCC 和对照组织中DHCR7 mRNA 表达森林图

图2 SMD 结果的检验漏斗图

2.2 HCC和非癌肝组织DHCR7 mRNA表达的sROC曲线结果

经过进一步计算，总特异性（specificity）、总敏感性（sensitivity）分别为0.81（95%CI：0.74～0.87）与0.60（95%CI：0.50 ～0.65）（图3）。最后，基于各数据的综合计算，sROC 曲线拟合AUC 为0.77（95%CI：0.73 ～0.81）（图4），这进一步证实了HCC 组织中DHCR7 mRNA 表达的上调。因此，DHCR7 具有鉴别HCC 的潜力。

图3 HCC 组织DHCR7 过表达的判别结果

图4 具有预测与置信区间的集成工作特性曲线（sROC）

2.3 DHCR7 蛋白在HCC 中表达趋势

DHCR7 蛋白在细胞质及细胞膜上表现为阳性信号。如图5 所示，HPA 数据库中DHCR7 蛋白在健康肝脏切片中弱染色，但在HCC 中强染色，说明DHCR7 在HCC 中的表达显著高于健康肝脏（P＜0.05）。AUC 值为0.77，进一步支持了DHCR7 蛋白在HCC 组织中明显过表达的发现（图4）。

图5 HCC 与非癌肝组织中DHCR7 蛋白表达水平的免疫组化图

3 结论与讨论

本研究第一次探索了DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 中的表达情况，并对其进行了相关的拓展研究。通过来自TCGA、GEO、GTEx、ArrayExpress 等权威数据库的数据集、RNA 测序结果以及组织芯片数据等途径，揭示了HCC 组织中DHCR7 的mRNA 转录和蛋白翻译水平的上调，涵盖了广泛的种族和人群。

本次研究最主要的发现是DHCR7 在HCC 中过度表达，这意味着DHCR7 可能是HCC 潜在的靶向标志物，为未来HCC 的诊断、治疗、预后预测等临床需求指出一条新的方向。

近年来，在某些实体肿瘤中，DHCR7 的高表达已经引起一些学者的注意。例如，有研究者称，DHCR7 在宫颈癌（Cervical Carcinoma，CCA）中的过表达可能导致CCA 的低生存率[11]。还有学者发现，DHCR7 作为一个独立的危险因素在膀胱癌中表达上调，并且与其分级和分期相关，最终可导致预后不良[12]。此外，有研究结果表明，由于DHCR7 基因对循环维生素D 水平的影响，多态性可能与甲状腺癌风险增加有关[13]。而在对胃癌的研究中，也有学者称DHCR7 基因的突变抑制了胃癌细胞的恶性行为，并通过抑制细胞胆固醇生物合成诱导凋亡[14]。作为脂质代谢相关基因，DHCR7 也被发现影响着头颈部鳞状细胞癌的临床特征，譬如分期、性别和病理分期等[15]。即便在未知部位原发癌（Cancer of Unknown Primary，CUP）的全基因组关联研究中，也发现DHCR7 作为编码胆固醇和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成中的关键酶与CUP 的肝转移有一定关联[16]。这说明DHCR7 的表达异常，可能在多种肿瘤的进展途径中责任重大。

当然，HCC 作为全球发病率最高的癌症之一，研究其与DHCR7 相关性的文章近年也不断涌现，然而笔者发现，这些文章多是从胆固醇或维生素D 的代谢角度对肝癌的发生进行研究与分析，继而发现DHCR7 作为胆固醇与维生素D 代谢过程中的关键基因/酶与HCC 甚至肝脏疾病的关联性，且涵盖了HCC 从发生、发展到预后的各个临床阶段的研究。譬如，在发病风险方面，有研究通过脂代谢相关基因分析发现了维生素D 在HCV 相关性HCC 的发病风险中存在一定的作用，而DHCR7 在其中的作用不可忽视[9]。在基因调节方面，有研究通过功能富集分析发现，在由JFH-1 诱导出的丙型肝炎发展而成的HCC中，下调共调控基因与胆固醇代谢相关，DHCR7 正是其确定的中枢基因之一，并可能成为JFH-1 相关的HCC 的候选生物标志物[10]。在肝脏疾病的预后方面，有研究称，维生素D 代谢和VDR（维生素D 受体）-TGFβ-1（转化生长因子β-1）-SMAD3（Sma和Mad 相关蛋白）相互作用的潜在遗传变异可能影响丙型肝炎的进展，导致肝脏失代偿、纤维化、恶化、HCC 发展和肝脏死亡等不良预后，从而进一步发现，DHCR7 作为维生素D 代谢中的关键酶，4 个单核苷酸多态性（SNPs）与肝脏失代偿相关的结局有关，而肝脏失代偿与肝癌的发生密不可分[17]。

与众不同的是，本研究直接关注了DHCR7 与HCC 的关系，直接提供了DHCR7 在HCC 中存在过表达的证据，发现DHCR7 可能是导致HCC 发生的独立因素。然而，由于本研究还未在HCC 患者的血液中检测DHCR7 水平，其在HCC 的早期筛查中的作用仍须更进一步的研究。同时，DHCR7 的高表达也导致一些HCC 患者的预后较差，但这一发现需要未来用更多的样本进行验证。总之，这是第一项直接评估DHCR7 在HCC 中可能的临床价值的研究。

至于DHCR7 在诱导HCC 发生中发挥作用的主要机制，现有的研究表明，在基因相关性研究和功能与途径富集分析中，均找到了DHCR7 与HCV 诱导的HCC 具有相关性的证据[9-10]。本文直接揭示了DHCR7 在HCC 组织中mRNA 水平的升高和蛋白质的过表达，为DHCR7 与HCC 相关性研究中的证据链补充了重要的一环。

有趣的是，在过去发现DHCR7 与HCC 的发病风险、发展及预后等临床表现存在相关性的文章中，被研究的对象多为HCV 诱导发生的HCC，即HCC 的原发疾病被限定为丙型肝炎，而DHCR7 参与调节HCC发生发展的方式是作为维生素D/胆固醇代谢的关键基因[9-10,17]。然而在另一些研究对象不限于HCV 相关性HCC（如酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病、乙肝病毒等导致的HCC）的文章中，也得出了异常胆固醇/维生素D 代谢影响HCC 发生、发展、转归等方面的结论[3,18-19]。与此同时，本文发现，在不同原因导致的HCC 中，都能发现DHCR7 的过表达。因此，通过合理推测，DHCR7 作为调节胆固醇/维生素D 的关键基因对于HCC 发生发展的调节作用，广泛存在于不同原因导致的HCC 中。未来对于DHCR7在HCC 中分子机制的研究，不应当将研究对象局限于HCV 相关性HCC，而应当对不同肝脏原发病导致的HCC 进行广泛研究，尤其是增加对非HCV 相关性HCC 的研究，以找到其中共同的分子机制以及几者之间的不同之处，丰富DHCR7 在HCC 中的相关性研究，发掘DHCR7 作为HCC 治疗靶点的潜力。

本研究不可避免地有其局限性。虽然获得了DHCR7 在HCC 过表达的mRNA 和蛋白组学证据，然而DHCR7 的生物学功能和相关的生物分子途径尚未通过各种对比实验在HCC 中得到验证。未来，必将需要更完整、更具体的工作来解释DHCR7 在HCC 的确切作用机制。