基于三联体和金门克隆的快速TALE 模块组装技术

周继曾，杨洋，鹿璇，李双鹏，邹庆剑，张焜,*

（1.广东工业大学 生物医药学院，广东广州 510530；2.五邑大学 生物科技与大健康学院，广东江门 529020）

转录激活因子样效应物（Transcription Activator-Like Effector，TALE）是一种能识别特定DNA 序列的蛋白，最早由科学家在植物病原菌黄单胞菌（Xanthomonas）中发现，其天然功能是直接调节宿主基因表达。在通过细菌Ⅲ型分泌系统侵染进入宿主细胞后，TALE 进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应器特异性序列结合并激活转录[1]。TALE 主要由N 端、C 端和中间的DNA 结合域（DNA Binding Domain，DBD）三部分组成。DNA 结合域由含34 个氨基酸（Amino Acid，AA）重复序列串联组成，每段重复序列模块的第12 和13 位氨基酸为重复可变二残基（Repeat Variable Di-residues，RVD），其中4 种常见的RVD 是NI、NG、HD 和NN，分别识别核苷酸A、T、C 和G[2]。与CRISPR/Cas9 系统相比，TALE具有其独特优势。例如，TALE 可以灵活地融合各种蛋白，如与核酸内切酶Fok Ⅰ融合靶向目标序列进行DNA 双链切割[3]、与转录调控域融合进行基因激活[4]，以及与核酸酶或脱氨酶融合实现CRISPR/Cas9 系统难以完成的线粒体基因组编辑，作为线粒体疾病治疗的潜在工具[5-8]。此外，TALE 核酸酶（TALENs）的识别范围为10 ～31 个碱基对（bp），具有脱靶风险低的优势[9-10]，比CRISPR/Cas9 系统更适用于临床应用。然而，目前常用的TALE 组装方法，如金门（Golden Gate）克隆技术[11]、solid-phase 克隆技术[12]和 Gibson克隆技术[13]等都存在组装时间长、高成本、难操作的问题，限制了TALE 工具在基因打靶中的应用。

笔者开发了一种由Cas9/sgRNA 和TALE 组成的双导航系统的新型单碱基编辑器——TaC9-BE[14-15]，它不仅能在不产生DNA 双链切割的情况下在靶位点实现精准高效的碱基C-T 或A-G 替换，而且没有可预测DNA 脱靶效应，为基因治疗和转基因生物的产生提供了一种安全的工具。然而，TALE 构建的复杂性成为TaC9-BE 应用的主要障碍。本研究通过新开发的TALE 三联体结合金门克隆技术建立一种新的TALE 构建技术——Trimer-Golden Gate（Tri-GG），该方法可高效、快速、简易地组装TALE，为TaC9-BE系统提供了便捷的TALE 服务。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与细胞

质粒EFS-ABE8EdelR153-TALE-EGFP（LacZ）和EFS-YE1-TALE-EGFP（LacZ）、nCas9-mCherry、UGI-nCas9-UGI-mCherry、gRNA 骨架载体、TALE三联体库等，均由五邑大学邹庆剑课题组实验室构建，并存于-20 ℃冰箱；大肠杆菌（Escherichiacoli）感受态细胞DH5α 菌株和实验所需所有引物，均购于广州艾基生物技术有限公司；HEK293T 细胞，购自美国ATCC 生物生物标准品资源中心。

1.1.2 试剂

DNA marker，日本Takara Bio 公司；Ⅱ型限制性核酸内切酶（Esp3I 和BbsI）、高糖培养基，美国Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 连接酶，美国New England Biolabs 公司；PCR 酶和质粒提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；转染试剂lipo 8000，上海碧云天生物技术有限公司；TE 缓冲液（Tris-EDTA）、0.5% NP-40、10 μg/mL 蛋白酶K，德国Merck 公司；10%胎牛血清，美国Cytiva 公司；1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉（Gene Star），青岛金斯达生物技术有限公司；1%氯化钠，天津市大茂化学试剂厂。

1.1.3 仪器

LHG-3_G-F8 生物安全柜，新加坡Esco 公司；HERA cell 150i1 型细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific 公司；OK-8D 三孔水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；IX73 荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；DYY-6C DNA 凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司；2FD 超净工作台，瑞智精密股份有限公司；T100 PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；LRH-70 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。5425R 常温离心机，德国Eppendorf 公司；3000 超微量分光光度计，美国Nanodrop 公司；1600 凝胶成像仪，上海天能生命科学有限公司；MoFlo™ XDP 流式分选仪，美国Beckman Coulter 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TALE 的构建

TALE 三联体由非重复的306 bp DNA 序列组成，其表达产物为3 个RVD 重复单元，可结合任意3 个连续DNA 核苷酸序列，如图1（a）所示。以TALE三联体为模板，设计具有特定末端序列的引物，通过PCR 扩增出三联体片段中末端具有Ⅱ型限制性核酸内切酶（Esp3I）的识别序列。不同引物对扩增出的片段，经酶切后产生突出末端可以按顺序首尾互补配对，如图1（b）和表1 所示。三联体扩增体系：反应总体系为20 μL，其中2×Phanta Max Master mix为10 μL，扩增三联体两条引物（10 μmol/L）分别加0.5 μL，三联体模板取10 ng，补充dd H2O 至20 μL。三联体PCR 扩增程序：98 ℃预变性1 min， 98℃变性10 s、60℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，循环30 次。扩增片段胶回收纯化后，与TALE 骨架载体混合，反应体系为1 μL 连接缓冲液，Esp3I 和T4 连接酶各0.5 μL，混合PCR 产物100 ng，TALE 骨架载体60 ng，加ddH2O 补充至总体系10 μL。反应程序为37 ℃酶切5 min 和16 ℃连接5 min，循环10 次，最终实现在一个反应体系中实现多片段的有序连接，完成TALE模块组装，如图1（c）所示。

表1 三联体扩增引物序列

图1 简并密码三联体金门法组装TALE 的流程

1.2.2 菌液PCR 鉴定及测序鉴定

将金门克隆反应液转移至DH5α 感受态细胞中进行转化，冰浴30 min 后放入42 ℃水浴热激1 min后，继续冰浴3 min。最后加入含有X-Gal（200 μg/mL）和IPTG（1 mmol/L）的LB 平板上，放置37 ℃培养箱中12 h。第二天，观察平板菌落，挑取白色单菌落，加入含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37 ℃摇菌8 h。取10 μL 菌液高温裂解后，用作PCR 鉴定的扩增模板。PCR 鉴定引物序列如下，CEXU-F：A A C G T G G C G G C G T G A C C G C A；C E X U-R：GGTGGTCGTTGGTCAACGCGG。 菌液PCR 体系：2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，两引物（10 μmol/L）各0.5 μL，裂解后的菌液0.5 μL，补充ddH2O 至总体系10 μL。PCR 扩增程序：98 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s，循环30 次。PCR 产物凝胶电泳，初步鉴定正确的菌液样品，然后测序进一步验证载体序列是否正确。引物为CEXU-F和CEXU-FR。测序正确的TALE 载体用于后续细胞水平的功能性测试。

1.2.3 gRNA 载体的构建

根据5 个靶位点序列合成sgRNA 寡核苷酸链，将100 μmol/L 的正链和反链各取1 μL 混合，加ddH2O至20 μL，进行退火。退火程序：95 ℃孵育10 min后以0.1 ℃/s 的速度降低样品温度，直到16 ℃。退火后，与线性化gRNA 骨架载体（BbsI 酶切）混合，配制连接反应体系：连接缓冲液1 μL，T4 连接酶0.5 μL，退火产物5 μL，gRNA 骨架载体100 ng，加ddH2O 补充至10 μL，16 ℃孵育1 h。反应完成后，加入DH5α感受态细胞进行转化，转化过程同1.2.2步骤。最后提取质粒进行测序鉴定，测序正确的样品用于后续的细胞实验。sgRNA 的引物名称和序列见表2。

表2 sgRNA 引物序列

1.2.4 细胞转染和流式分选

用lipo8000 转染试剂将gRNA、TALE-EGFP和nCas9-mCherry 表达质粒按1 ∶1 ∶2 的比例共转染到293T 细胞中，同时将gRNA 和ABE8EdelR153-mCherry 或YE1-BE4max-mCherry 作为对照共转染到293T 细胞中。转染48 h 后，细胞通过流式分选仪进行分选收集带红色荧光和绿色荧光的细胞。

1.2.5 PCR 扩增和测序

将分选的细胞样品离心收集后，加入10 μL 的NP40/蛋白酶K 裂解液，裂解程序为56 ℃裂解1 h，95 ℃处理10 min 使酶失活。裂解产物作为PCR 鉴定的模板。PCR 反应体系：2×PhantaMax Master mix 10 μL，靶位点上下游引物（10 μmol/L）2 μL，细胞裂解物2 μL，ddH2O 补充至20 μL。PCR 扩增程序同1.2.1 步骤。收集PCR 产物，通过琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化目标条带。最后将目标产物送金维智公司进行一代测序。目的条带的扩增引物序列见表3。测序结果通过EditR（https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/）分析，并用GraphPad Prism8 软件进行数据统计分析。

表3 靶位点及其扩增引物序列

2 结果与分析

2.1 TALE 的构建

常用的TALE 靶序列长度为13 ～18 bp，笔者构建的TALE靶向AAVS1 site位点序列为GGGTACTTTTATC（13 bp），以GGG TAC TTT TAT CNN 对应的三联体为模板，分别用引物对1F+1R、2F+2R、3F+3R、4F+4R、5F+R+1 扩增出5 个三联体片段，其中1 ～4 的片段大小为306 bp，5 的片段大小为102 bp。TALE 靶向ABE site2、ABE site1、HEK site 和RNF site 的靶序列分别为14 bp、16 bp、17 bp 和18 bp。同理，分别按顺序每3 个核苷酸对应的三联体为模板，每个模板按顺序用相应的引物对进行扩增，扩增产物PCR 凝胶电泳图见图2（a）。

图2 扩增TALE 三联体片段及连接转化

PCR 产物回收后，与TALE 骨架载体通过金门克隆技术快速组装。转化后在通过蓝白斑筛选平板中长出的单菌落均为白斑[图2（b）]，说明载体连接效率高，没有原载体转化克隆。对白色菌落进行PCR鉴定。由于TALE 模块的序列的重复性，具有正确模板的PCR 产物在凝胶电泳上形成了一系列DNA 阶梯带（约300 bp 间隔）。

5 个TALE 载体构建的电泳条带正确率平均超过50%（AAVS1 site TALE 7/10、ABE site1 TALE 4/10、ABE site2 TALE 5/10、HEK site TALE 5/10、RNF site TALE 6/10），如图3（a）所示。经进一步测序比对，证实PCR 条带为大小正确的载体。经测序比对，发现其中有约40%与预计序列完全相同[图3（b）]，为成功构建的TALE 载体。

图3 菌液PCR 鉴定及测序统计

2.2 通过细胞基因编辑验证Tri-GG TALE 的功能

TaC9-BE 编辑系统为双向导基因编辑器，两个向导分别为sgRNA 和TALE。5 个TALE 载体已经成功构建的前提下，根据其识别序列的上游6 ～10 bp 处设计sgRNA靶向位点。gRNA和TALE识别序列见表4。经测序，5 个位点的gRNA 载体成功构建。

表4 基因位点的gRNA 和TALE 识别序列

在成功构建TALE 和sgRNA 载体的基础上，将TALE 与脱氨酶TADA8EdelR153融合，与nCas9/gRNA组成TaC9-ABEdelR153编辑系统，如图4（a）所示；同理，TALE 与YE1 融合，与UGI-nCas9-UGI/gRNA 组成TaC9-CBEYE1编辑系统，如图4（b）所示。TaC9-ABEdelR153和TaC9-CBEYE1载体系统分别转染试剂到HEK293T 细胞。收集细胞对目标位点进行测序证实，TaC9-ABEdelR153能在五个位点都具有高效A 到G 的单碱基转换，同样，TaC9-CBEYE1能在5 个位点也具有高效C 到T 的单碱基转换效率，如图4（c）所示。经统计，在所有5 个位点的编辑TaC9-BE 编辑系统与常规胞苷或腺苷单碱基编辑系统具有相同的编辑能力，如图4（d）和图4（e）所示，说明用Tri-GG 克隆技术构建的TALE，具有高效靶向DNA 结合能力，有效应用于基因编辑。

图4 TaC9-BE 系统的示意图和在5 个基因位点上的编辑效率

3 讨论

TALE 一直作为一项强大的DNA 靶向工具被广泛使用，但由于构建方法较为复杂、成本高、耗时长等限制，其近年来被CRISPR/Cas9 系统所替代。由于TALE 自身独特的优势，最近被用于消除可预测的脱靶效应的TaC9-BE 系统和线粒体单碱基编辑中。通过传统的Golden Gate 克隆技术组装TALE 需要分两步进行组装，复杂且耗时长。本研究通过TALE 三联体库结合Golden Gate 组成的新的克隆技术Tri-GG，具有易操作、低成本且仅需一步反应即可组装TALE的优势，且能保证TALE 靶向DNA 的功能性。

在用Tri-GG 法构建TALE 识别序列为13 bp、16 bp 时，扩增的最后一个三联体是单个TALE 模块，由于条带较小导致回收浓度较低。因此，建议在设计TALE 识别序列长度时，尽量选择3 的整数倍。在菌液PCR 鉴定正确而一代测序结果出现点突变时，可尝试更换高保真的PCR 酶或连接酶来提高正确率。对于构建识别序列长度超过18 bp 的TALE 时，建议扩大连接反应的循环数。

4 结论

本研究通过TALE 三联体结合金门克隆技术建立一种新的TALE 构建技术——Tri-GG，成功构建了5 个位点的TALE 载体。将TALE 与脱氨酶融合后，与nCas9/gRNA 组成Tac9-BE 系统，在293T 细胞中实现了高效的单碱基编辑。本技术为TALE 的构建和应用提供了一个新的简单快速的方法。