基于网络药理学及分子对接探讨“白芍-牡蛎”药对治疗多囊卵巢综合征的作用机制Δ

征 征,郁 悦,刘庭秀,杨靓靓,王裕星,刘新敏(1.中国中医科学院广安门医院妇科,北京 100053; 2.中国中医科学院研究生院,北京 100091; 3.北京中医药大学研究生院,北京 100029; .大连医科大学第二附属医院内科,辽宁 大连 116023)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)为常见的女性生殖内分泌疾病,发病率高达15%～20%[1],且呈逐年升高趋势[2]。目前,PCOS发病机制不明,可能涉及遗传因素、环境因素、氧化应激及慢性炎症等[3-4]。PCOS患者发病以高雄激素血症、卵巢多囊样变和排卵障碍为特征,主要表现为月经稀发、闭经、不孕、多毛、痤疮、肥胖及胰岛素抵抗(IR)等,长期患病可引发2型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌等不良结局。西医治疗主要以口服药物为主,但其不良反应较多,且停药后易反复。近年来,中医药治疗PCOS受到广泛认可,2018年《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》[5]认为中医药为该病的有效治疗手段。PCOS患者多伴有黄体生成素(LH)水平升高,中国中医科学院广安门医院刘新敏教授根据多年临证经验,认为PCOS高LH血症多与肝阳上亢有关。PCOS患者常情志不畅,急躁易怒,易引发肝火,上扰清阳,常眼干眼胀、失眠多梦;内耗阴血,则见月经稀发、闭经。故予以镇肝熄风汤加减治疗。其中“白芍-牡蛎”药对是处方的核心部分,白芍酸甘,可滋阴柔肝,平抑肝阳;牡蛎咸涩,可收敛固涩,重镇潜阳,两药一酸一涩,一柔一敛,可有效降低PCOS患者的LH水平,有助自主月经产生。现代药理学研究结果发现,白芍有一定的抗炎、降糖作用[6];牡蛎具有抗氧化、降糖、免疫调节作用[7],对PCOS慢性炎症、氧化应激状态及IR均可起到改善作用。本研究拟通过网络药理学及分子对接,从基因、蛋白、通路等多角度探讨“白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的机制,为后续相关研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 “白芍-牡蛎”的活性成分及靶点提取

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、HERB(http://herb.ac.cn)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库获取白芍、牡蛎的主要活性成分及其作用靶点,选取口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,或BATMAN-TCM数据库中参数得分≥20,P<0.05,或经文献检索[8-9]证实为核心成分的化合物作为药物活性成分予以初步纳入,通过TCMSP、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、BATMAN-TCM、中国知网(https://www.cnki.net/)及PubMed(http://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库对上述化合物的作用靶点进行查询,去除无对应人类相关靶点的化合物,作为“白芍-牡蛎”药对最终的活性成分,并在Uniprot网站(https://www.uniprot.org/)将靶点名称转换为基因ID,对其靶点进行进一步提取与归类。

1.2 PCOS疾病靶点预测及其与“白芍-牡蛎”的交互靶点采集

以“Polycystic ovarian syndrome”“PCOS”为关键词,通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)收集PCOS疾病靶点,获取“白芍-牡蛎”药对与PCOS的交互靶点,得到“白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的预测靶点,并作韦恩图进行可视化分析。

1.3 “白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的药物-成分-靶点网络构建

通过Excel软件整理药物-成分-靶点之间的联系,将其导入Cytoscape软件,建立药物-成分-靶点-疾病网络,并选取其中度值排序居前3位的化合物作为“白芍-牡蛎”药对的核心活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

通过STRING数据库构建PPI网络,去除游离节点,并采用Cytoscape软件进行可视化分析,选取度值>2倍中位数的节点作为核心靶点。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因百科全书(KEGG)通路富集分析

使用DAVID数据库进行GO及KEGG分析,得到富集的GO条目及KEGG通路后,选取P<0.05,Count值排序居前10位(含并列第10位)的GO条目/通路,使用微生信作图网站分别作Bar图及气泡图,进行进一步可视化分析。

1.6 分子对接验证

选取“白芍-牡蛎”药对中的核心活性成分以及PPI网络中得到的核心靶点进行分子对接验证。通过PubChem数据库(https://pubchemncbi.nlmnih.gov/)获取核心活性成分的结构,通过PDB蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)获取核心靶点的蛋白结构,通过PlayMolecule网站(playmolecule.com)预测分子的活性口袋,最后使用AutoDock软件进行分子对接,获取各个对接方式所需的最低结合能,并使用微生信网站作出对应的Heatmap以进一步可视化分析。选取最低结合能排序居前5位的药靶对接方式,通过PyMol软件进行分析,选取其中能够以较稳定氢键结合的对接方式作图,展示其氢键数目、距离及分子间相连接的氨基酸残基名称等对接细节。

2 结果

2.1 “白芍-牡蛎”的活性成分及靶点提取

最终筛选得到15个化合物,其中9个来源于白芍,6个来源于牡蛎,见表1。在Uniprot网站将靶点名称转换为基因ID。去除重复靶点后,最终得到117个靶点,其中89个来源于白芍,30个来源于牡蛎(两药有2个共同靶点)。

表1 “白芍-牡蛎”的活性成分Tab 1 Active components of “radix paeoniae alba-concha oyster”

2.2 PCOS疾病靶点预测及其与“白芍-牡蛎”的交互靶点采集

通过GeneCards数据库共获取到3 142个PCOS疾病作用靶点,将其与“白芍-牡蛎”药对的作用靶点取交集,发现PCOS与“白芍-牡蛎”药对共有71个共同靶点。

2.3 “白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的药物-成分-靶点网络构建

将“白芍-牡蛎”药对的主要成分及其与PCOS的交互靶点导入Cytoscape软件,得到由84个节点及102条边构成的药物-成分-靶点网络,见图1。图1中,橙色为药物,黄色为成分,成分图形面积与对应的靶点数目成正比,蓝色为靶点。其中,BS4(山柰酚,度值为38)、BS3(β-谷甾醇,度值为22)、BS1[(+)-儿茶素,度值为7]为度值排序居前3位的化合物,即为“白芍-牡蛎”药对中的核心活性成分。

图1 “白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的“药物-成分-靶点”网络Fig 1 “Drug-ingredient-target” network of “radix paeoniae alba-concha oyster” in the treatment of PCOS

2.4 PPI网络构建

在STRING数据库中得到由70个节点及463条边构成的PPI网络,导入Cytoscape软件进一步可视化分析,见图2。图2中,红色部分为核心靶点。分析得出PPI网络的度值中位数为11,选取度值>2倍中位数的节点作为核心靶点,共选取到11个核心靶点,见表2。

图2 PPI网络图Fig 2 PPI network

表2 核心靶点列表Tab 2 List of core targets

2.5 GO功能富集分析

通过DAVID数据库对相关靶点进行GO分析,共富集到514条GO条目。将P<0.05的GO条目进行进一步筛选,最终得到264条,包含生物过程(BP)相关GO条目191条,细胞组分(CC)相关GO条目30条,分子功能(MF)相关GO条目43条。选取排序居前10位(包含并列第10位)的条目,使用微生物作图网站(www.bioinformatics.com.cn)对其进行可视化分析,Bar图见图3。BP主要集中在信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、细胞增殖负调控、蛋白磷酸化、凋亡过程的调控及负调控、细胞黏附、正向调节细胞迁移、离子跨膜运输、胞质钙离子浓度的正调控、血管生成的正向调节和蛋白质磷酸化的正向调节等方面;CC主要集中在膜整体组分、细胞质基质、细胞质、外泌体、高尔基体、线粒体、细胞质核周区、细胞内面细胞器、核染色质和内质网等方面;MF主要集中在转录因子活性、序列特异性DNA结合、锌离子结合、氧化还原酶活性、铁离子结合、钙调蛋白结合、转录调控区序列特异性DNA结合、Scaffold蛋白结合、单氧酶活性、β-淀粉样蛋白结合、蛋白酶结合和肽酶活性等方面。

图3 GO功能富集分析Fig 3 GO functional enrichment analysis

2.6 KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库对相关靶点进行KEGG分析,共富集到126条通路。将P<0.05的通路进行进一步筛选,最终得到53条通路。选取排序居前10位(包含并列第10位)的通路,进行可视化分析,气泡图见图4。作用通路主要集中在磷脂酰肌醇3激酶-Akt(PI3K-Akt)通路、神经活性配体-受体交互作用、钙信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路和NOD样受体信号通路等方面。

图4 KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG functional enrichment analysis

2.7 分子对接验证

选取“白芍-牡蛎”药对中的核心活性成分山柰酚、β-谷甾醇、(+)-儿茶素与PPI网络中得到的11个核心靶点,进行分子对接,分子对接热图见图5,可见其结合能主要集中于-35～-10 kJ/mol,分子间结合较好。选取最低结合能排序居前5位的药靶对接方式,通过PyMol软件进行分析,选取其中能够以较稳定氢键结合的对接方式,分别为β-谷甾醇-TNF、β-谷甾醇-CAT,将其对接细节进行展示,见图6—7。β-谷甾醇可与TNF中的TYR-151氨基酸残基形成1个距离为2.4Å的氢键,与CAT中的ARG-66氨基酸残基形成3个距离分别为2.3 Å、2.3 Å和2.6 Å的氢键。

图5 分子对接热图Fig 5 Molecular docking heat map

图6 β-谷甾醇-TNF分子对接细节Fig 6 Detail of Beta-sitosterol-TNF molecular docking

图7 β-谷甾醇-CAT分子对接细节Fig 7 Detail of Beta-sitosterol-CAT molecular docking

3 讨论

“白芍-牡蛎”药对取自近代名医张锡纯《医学衷中参西录》中的镇肝熄风汤,刘新敏教授认为PCOS伴见高LH血症的患者多为肝肾阴虚,肝阳上亢,属上盛下虚态,使用白芍可补肝阴、柔肝体;牡蛎可敛肝阳、平肝风,两药相合,使上亢之阳得以沉降,下竭之阴得以敛润,阴平阳秘,机体调和。

本研究通过网络药理学方法,发现山柰酚、β-谷甾醇和(+)-儿茶素为“白芍-牡蛎”药对的核心活性成分。文献报道,慢性低度炎症状态、氧化应激在PCOS的发病过程中具有重要作用[3-4]。研究结果表明,山柰酚具有抗氧化、抗炎、防治糖尿病以及抑制蛋白激酶等多方面的作用,可显著抑制脂质微粒系统中的还原型辅酶Ⅱ或Fe2+诱导的脂质过氧化,清除超氧化物阴离子,从而产生抗氧化应激作用[10];其抗炎的作用机制主要包括调控炎症相关基因表达,抑制转录因子、黏附分子相关表达以及细胞中PI3K和Akt的磷酸化[11],可改善PCOS患者的慢性炎症状态;降糖方面,山柰酚可提高脂肪细胞摄取葡萄糖的能力,有效降低小鼠空腹血糖和IR,改善糖脂代谢紊乱,从而提高机体胰岛素敏感度,对PCOS所致IR可起到治疗作用[12]。β-谷甾醇具有明显的抗氧化活性,抗炎、降糖和降脂作用。研究结果显示,β-谷甾醇可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低过氧化氢酶活性,清除羟自由基及超氧阴离子,从而抑制氧化应激反应的发生[13];研究结果发现,β-谷甾醇可通过减少机体的NO合成而减少IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌,从而达到抗炎效果[14];β-谷甾醇可通过下调PI3K、Akt的表达,对葡萄糖的吸收、脂肪的合成与分解发挥调节作用,故不仅可治疗PCOS导致的IR,还可用于控制肥胖型PCOS患者的体重[15]。儿茶素具有很强的清除自由基和抗氧化的作用,相较于(-)-儿茶素,(+)-儿茶素更能有效阻止杂环胺所致DNA氧化损伤[16];儿茶素还能改善胰岛素敏感性,从而治疗IR,并可加快脂代谢,促进脂肪分解,这对于PCOS患者的IR、肥胖均可起到改善作用[17]。

本研究在PPI网络构建中,筛选出IL-6、TNF、Akt1、PTGS2、PPARG、CASP3、CAT、ESR1、NOS3、HMOX1和MAPK8为“白芍-牡蛎”药对治疗PCOS的核心靶点。IL-6、TNF作为炎症相关因子,在PCOS的发生发展中,起到了较为关键的作用。IL-6在PCOS患者体内表达水平升高,与高雄激素血症、肥胖和IR等表现关系密切[18]。IL-6可调节胰岛素受体底物-1(IRS1)以及激活Akt,从而抑制胰岛素信号通路,最终导致IR[19]。研究结果发现,IL-6可通过Akt-信号转导及转录激活因子3信号通路使脂肪细胞增殖,从而导致PCOS患者超重、肥胖。IL-6也是PCOS患者远期产生心血管疾病的危险因素之一[20]。研究结果表明,TNF是PCOS治疗中的潜在关键靶点之一,不仅参与了系统性炎症的发生、发展,还在黄体细胞和颗粒细胞的凋亡中发挥关键作用,TNF的过高表达也是PCOS的特征性表现[21]。研究结果发现,PCOS大鼠血清TNF-α与睾酮水平呈正相关,且TNF可激活PI3K-Akt-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路下调胰岛素信号通路,促使PI3K、Akt等磷酸化IRS1,从而抑制机体对葡萄糖的摄取,并导致机体对胰岛素敏感度下降,导致IR的发生[22]。本研究的分子对接验证中,β-谷甾醇与TNF对接较好,或可说明“白芍-牡蛎”药对通过影响以上通路发挥作用。

本研究的GO功能富集分析结果发现,“白芍-牡蛎”药对主要通过调控信号转导、蛋白磷酸化、凋亡过程的调控及负调控、细胞黏附、离子跨膜运输、转录因子活性、序列特异性DNA结合和氧化还原酶活性等方面治疗PCOS。KEGG分析结果发现,PI3K-Akt等通路为“白芍-牡蛎”药对作用的关键通路。研究结果显示,PI3K-Akt信号传导可影响PCOS患者的卵泡发育及颗粒细胞功能,并且是PCOS患者产生糖耐量异常的主要机制,与PCOS所致IR关系密切[23]。作为胰岛素信号传导的主要途径,课题组前期研究结果发现,中药可通过PI3K-Akt通路改善PCOS相关症状,提高患者胰岛素敏感性,从而治疗PCOS所致IR[24]。研究结果表明,PCOS导致的IR可使胰岛素代偿性升高,而升高的胰岛素又可使PCOS患者促性腺激素释放激素和LH的分泌量及分泌频次显著升高,并可促进LH的活性。因此,通过治疗PCOS所致IR,提高胰岛素敏感性,可起到降低LH水平的作用[25]。

综上所述,“白芍-牡蛎”药对主要通过山柰酚、β-谷甾醇和(+)-儿茶素等核心成分,作用于IL-6、TNF和Akt1等靶点及PI3K/Akt等通路,起到抗炎、抗氧化应激、增强胰岛素敏感性、降低LH水平等效果,从而治疗PCOS。本研究为临床使用“白芍-牡蛎”药对治疗PCOS提供了基础依据,未来仍需进一步的细胞实验、动物研究以明晰结论,指导临床。