酶联免疫吸附法与高效液相色谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1的比较

高志存,石露莎,余舒宁,杞虹,高芸,李水兰,段文学,崔惠娟*

(1.红河州动物疫病预防控制中心,云南 蒙自 661199; 2.个旧市动物疫病预防控制中心,云南 个旧 661099; 3.建水县动物疫病预防控制中心,云南 建水 654399)

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)主要是由黄曲霉、寄生曲霉等产生的一类化学结构类似的次生代谢产物,被世界卫生组织(WHO)认定为I类致癌物,是一种毒性极强的物质,其中,黄曲霉毒素B1(AFB1)检出率较高、毒性最强、有强致癌性。研究发现,玉米、豆粕等饲料原料霉菌毒素污染状况日益严重,已成为饲料工业和畜牧业生产中不可忽视的问题[1-3]。

目前,国内外检测黄曲霉毒素的方法主要包括酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫亲和荧光光度法、免疫层析法,其中,酶联免疫吸附法与高效液相色谱法是检测饲料中AFB1最常用的方法[4]。本文通过采用酶联免疫吸附法与高效液相色谱法对玉米中AFB1含量测定结果进行比较,验证酶联免疫方法试剂盒的准确性,以期为今后实验室玉米中AFB1的检测工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米,来源于饲料生产企业、畜禽养殖场,玉米样品按GB/T 20195—2006《动物饲料 试样的制备》用四分法缩减至500 g,粉碎后过40目筛,混匀后装入样品瓶中备用。

1.2 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪,配2475荧光检测器;SpecteaMax 190酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;HF2500光化学衍生器,北京华安麦科生物技术有限公司;AG-204电子天平,瑞士梅特勒公司;隔水式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;漩涡振荡器,Thermo Scientific;5804R冷冻离心机,德国Eppendorf公司;黄曲霉毒素B1免疫亲和柱,批号Q030781,规格3 mL,有效期2024-09-07,北京美正检测技术有限公司;甲醇中黄曲霉毒素B1标准溶液,100 μg/mL,批号22120720,有效期2025-01-08,坛墨质检科技股份有限公司;黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒,批号H010822A,生产日期20230328,江苏省苏微微生物研究有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯,Merck公司;超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1酶联免疫吸附法

1.3.1.1黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒组成

测试盒含包被抗体的反应板96孔,样品稀释液2瓶,AFB1标准溶液1套(0、0.1、0.25、0.5、1、2 ng/mL),酶标抗原4瓶,酶标抗原稀释液1瓶,浓缩洗涤液1瓶,显色底物液a 1瓶,显色底物液b 1瓶,终止液1瓶,反应板框架1块。

1.3.1.2试剂配制

60%甲醇-水溶液:取无水甲醇,用超纯水按6∶4体积比稀释。

酶标抗原溶液:每瓶酶标抗原中准确加入1.5 mL酶标抗原稀释液,充分溶解,2～8 ℃保存。

洗涤工作液:将浓缩洗涤液用超纯水按1∶19体积比进行稀释。

1.3.1.3样品前处理

称取饲料样品5.0 g于50 mL离心管中,加入25 mL 60%甲醇-水溶液,混匀;摇床300 r/min剧烈振荡15 min;4 000 rpm/min离心10 min;取上清液用样品稀释液适当稀释作为待测液。

1.3.1.4试剂盒检测

取出酶联免疫试剂盒,室温(20～25 ℃)放置30 min以上;将标准品和样品对应微孔编号,每个做2孔平行;每孔加入250 μL洗涤工作液,放置40 s,甩掉洗涤工作液,在吸水纸上拍干;分别加入标准溶液、待测液50 μL到对应孔中,每孔加入酶标抗原溶液50 μL,轻轻震荡混匀,遮盖后37 ℃恒温培养箱中反应30 min;小心揭开盖板,甩掉反应液,每孔加入洗涤工作液250 μL,充分洗涤5次,每次间隔40 s,甩掉洗涤工作液,在吸水纸上拍干;每孔加入显色底物液a和显色底物液b各50 μL,轻轻震荡混匀,遮盖后37 ℃恒温培养箱中显色15 min;每孔加入终止液50 μL,轻轻震荡混匀,于酶标仪450 nm处读取每孔OD值。

1.3.2高效液相色谱法

1.3.2.1标准溶液配制

黄曲霉毒素B1标准中间液:用单标线吸量管精密吸取甲醇中黄曲霉毒素B1标准溶液(100 μg/mL)1.0 mL,用甲醇稀释并定容至10 mL,配制成10.0 μg/mL的标准中间液,再分别用单标线吸量管精密吸取适量10.0 μg/mL AFB1标准中间液,用甲醇稀释并定容,配制成1.0 μg/mL、0.1 μg/mL的AFB1标准中间液。

黄曲霉毒素B1标准工作液:分别精密吸取适量0.1 μg/mL的黄曲霉毒素B1标准中间液,用流动相稀释并定容,配制成浓度为2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准工作液。

1.3.2.2样品前处理

称取饲料样品5.0 g于50 mL离心管中,加入25 mL 80%乙腈-水溶液,混匀;摇床300 r/min剧烈振荡20 min;5 000 r/min离心10 min;取上清液10 mL于100 mL烧杯中,加入70 mL水稀释,混匀,如液体不清亮,用玻璃纤维滤纸过滤,收集滤液作为上样液。将黄曲霉毒素B1免疫亲和柱连接于10 mL注射器下,准确吸取20.0 mL上样液注入到注射器中,去掉亲和柱下方堵头,调开开关,使液体以1～2滴/秒速度流出;待液体排干后,用10 mL水洗涤2次,流速2～3滴/秒,弃去全部流出液;准确加入1.0 mL甲醇洗脱,流速1滴/秒,收集洗脱液于离心管中,加入水定容为2.0 mL,经 0.45 μm滤膜过滤,上机测定[5]。

1.3.2.3高效液相色谱条件

色谱柱Luna ® C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相为甲醇+水(45+55);光化学衍生系统;检测波长采用激发波长360 nm,发射波长440 nm;柱温35 ℃,流速为0.8 mL/min,进样体积为50 μL[5]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

2.1.1酶联免疫法测定AFB1的标准曲线

以标准液浓度的常用对数值(IgC)为横坐标,各标准液孔吸光度值与0 ng/mL标准液孔吸光度值的比值(A标准液/A0)为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图1。由图1可知,在0～2 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.9999。

图1 酶联免疫法测定AFB1的标准曲线

2.1.2高效液相色谱法测定AFB1的标准曲线

将标准系列工作液分别在上述色谱条件下进行测定,以标准工作液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果见图2。由图2可知,在2.0～50.0 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.9999。

图2 高效液相色谱法测定AFB1的标准曲线

2.2 加标回收试验

在空白样品中添加高、中、低3个水平的AFB1标准溶液,每个添加水平做3个平行样,照样品前处理方法进行提取、净化后,分别采用酶联免疫吸附法、高效液相色谱法进行AFB1检测,结果见表1。由表1可知,两种方法3个添加水平AFB1回收率在93.5%～100.9%,满足GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》规定浓度水平范围在<0.1 mg/kg时,回收率范围在60%～120%的要求,表明两种方法回收率良好,都能满足实验室检测要求[6]。

表1 加标回收试验结果

2.3 玉米中AFB1含量测定结果比较

分别取10个不同来源的玉米样品,每个样品2份,分别重复测定2次。GB 13078—2017《饲料卫生标准》规定玉米加工产品等饲料原料中黄曲霉毒素B1的限量是≤50 μg/kg[7],由表2可知,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)测定玉米中AFB1含量,判定结果一致,样品中AFB1含量用ELISA检测超过限量要求的,用HPLC检测同样也超出限量要求,只是所测得的AFB1含量HPLC法小于ELISA法。

表2 玉米中AFB1含量测定结果对比表

2.4 玉米中AFB1两种检测方法的比较

从表3可以看出,相较于高效液相色谱法而言,酶联免疫吸附法具有检测时间短、低成本、操作简单等优点,适用于大批量样品的快速筛选。而高效液相色谱法,利用黄曲霉毒素B1免疫亲和柱选择性吸附样品液中黄曲霉毒素B1,可有效避免样品检测假阳性反应,适用于疑似样品的确证及精确定量。

3 结论

通过采用酶联免疫吸附法与高效液相色谱法对玉米中AFB1含量测定结果进行比较,得出两种方法对AFB1的判定结果一致,证明本实验室采用的酶联免疫试剂盒是准确的,ELISA操作简单快速,灵敏度高,适用于AFB1的快速筛选,高效液相色谱法耗时长、成本高,更适用于疑似样品的确证及精确定量。