云上黑山羊产羔性状分子变异KASP验证分析

朱兰,欧阳依娜,赵小红,王鹏,兰蓉*

(1.云南省畜牧兽医科学院,云南 昆明 650224; 2.云南立新羊业有限公司,云南 弥勒 652300; 3.云南省种羊繁育推广中心,云南 寻甸 655200)

繁殖性状关系到畜禽生产效率的高低,因此一直是家畜育种中重要的选育指标。云上黑山羊作为肉用黑山羊新品种,具有优良的繁殖性状[1],对这一优良性状相关分子基础的研究是云上黑山羊高繁品系培育的前提。近年来的相关研究找到一些与云上黑山羊产羔性状相关的基因或变异位点[2],但经过重复验证的位点或基因还较少。基于此,本研究选取前期全基因组关联分析(GWAS)研究中与云上黑山羊产羔性状存在潜在或显著关联的位点,应用准确性和经济性都很高的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)检测方法,进行位点关联性重复验证,以期为云上黑山羊产羔性状基因组选择提供可靠检测位点或基因。

1 材料方法

1.1 实验材料

实验样本192个,来自云南立新羊业有限公司和云南省种羊繁育推广中心云上黑山羊核心群母羊。颈静脉采血,EDTA抗凝,4 ℃保存。根据5个SNP位点侧翼序列设计引物,信息见表1。

表1 KASP检测引物序列

1.2 实验试剂及仪器

KASP试剂盒及引物合成均由LGC公司提供,去RNA酶水来自天根公司。实验在产自英国 LGC 公司的SNPline基因分型平台完成。

1.3 测定记录指标

记录场号、羊号、初产年度、初产季节、初产产羔数、经产胎次、经产产羔数,并计算平均产羔数。

1.4 实验方法

KASP检测流程如图1所示。应用Primer 5软件,根据位点上下50 bp序列设计引物,带有两种通用标签并连接SNP位点的两条正向引物和一条反向引物构成引物混合液(Primer Mix),带有不同荧光信号的检测引物构成主引物混合液(Master Mix)。PCR反应包括三个阶段,如图2所示。每个PCR反应包括:终浓度为5～50 ng模板2.5 μL、2×Master Mix 2.5 μL、Primer Mix 0.07 μL、2.5 μL去RNA酶水。三个阶段PCR反应程序具体如表2所示。

图1 KASP实验流程图

图2 KASP分型PCR反应流程图

表2 三个阶段PCR反应程序

1.5 数据扫描

PCR结束后,取出孔板,参照《ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System 实验操作规程》进行数据扫描,输出位点多态性检测图谱。

1.6 数据分析方法

1.6.1遗传多样性分析

应用GenAlEx 6.501软件进行等位基因频率、遗传多样性参数的计算,并进行 Hardy-Weinberg平衡检验。

1.6.2产羔性状相关因素分析

应用SAS 9.0的GLM过程分析5个位点多态性对初产产羔数和平均产羔数的影响,并对显著相关位点的不同基因型进行最小二乘分析,采用一般线性模型如下:

y=Xβ+ZKγK+e

注:y为表型向量,Xβ为固定效应,ZKγK为待检验标记效应,e为残差效应。

2 结果

2.1 遗传多态性分析结果

KASP技术对192个样本5个SNP位点平均检出率为99.06%,多态性检测图谱层次清晰(图3),5个位点均存在多态性,并计算各位点等位基因频率(图4);由表3可见,位点rs268244272和rs642265755处于Hardy-Weinberg不平衡(P<0.01),其他3个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),位点rs268244272在云上黑山羊群体中为低度多态性(PIC<0.25),其余4个位点均为中度多态性(0.25

图3 5个位点多态性检测图谱

图4 5个位点等位基因频率

表3 5个位点遗传多样性参数

2.2 产羔性状影响因素分析结果

2.2.1产羔性状GLM分析结果

由表4可见,位点rs268244272对初产产羔数影响极显著(P<0.01),对平均胎产羔数影响显著(P<0.05),其余4个位点对产羔性状影响不显著(P>0.05)。

表4 5个位点对产羔性状影响的GLM分析

2.2.2显著关联位点产羔性状最小二乘分析结果

位点rs268244272存在3种基因型:TT、CC和TC型。最小二乘分析表明(表5),TT型初产产羔数最小二乘均数极显著高于TC型(P<0.01),而平均胎产羔数TT型也显著高于TC型(P<0.05)。

表5 位点rs268244272不同基因型产羔性状最小二乘均数

3 讨论

KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术是目前最为经济快速灵活的基因分型手段,全球各大种业公司均采用 KASP 技术进行基因分析研究[3],目前已经发表了两千多篇文献,是一项成熟可靠的分型产品,对少量位点的检测较其他分型技术更能显现保证准确率而降低成本的优越性。本研究5个位点192个样本的KASP分型成功率在99%以上,检测图谱碱基分层清晰(图3),每个位点均检出多态性,说明KASP分型技术有效,所获数据可以用于后续分析。

初产产羔数和平均胎产羔数是云上黑山羊繁殖性状的主要选育指标,长期以来受人工选择的强度较大。而本研究位点多态性与产羔性状关联分析结果显示,位点rs268244272与云上黑山羊初产产羔数和平均胎产羔数均存在显著关联,并且这个位点处于Hardy-Weinberg非平衡状态,PIC值低于0.25,有效等位基因数仅为1.3,表明这一位点受到较强的人工选择,表现出较低遗传变异。这一结果与朱兰等的研究结果基本一致[4],一方面再次验证位点rs268244272与云上黑山羊产羔性状存在显著关联,rs268244272作为云上黑山羊繁殖性状选择的分子标记较为可靠;另一方面为云上黑山羊繁殖性状的选育成效提供了分子依据,也说明通过长期的人工选育,云上黑山羊繁殖性状关联位点不断纯合。

4 结论

位点rs268244272与云上黑山羊初产产羔数极显著相关(P<0.01),与平均胎产羔数显著相关(P<0.05),再次验证与云上黑山羊产羔性状关联的有效性,该位点可作为云上黑山羊产羔性状分子标记。