36种中药及其复方制剂对羔羊腹泻大肠杆菌的体外抑菌试验

刘昊,张备

(1.盘山县疾病预防控制中心,辽宁 盘锦 124100;2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,黑龙江 齐齐哈尔 161005)

羔羊大肠杆菌病又称羔羊大肠杆菌性腹泻,该病是由致病性大肠杆菌引起的一种羔羊急性、致死性传染病[1]。该病不仅能够感染2～8日龄的羔羊,而且还会使羔羊出现腹泻和败血症等临床症状,严重危害养羊业[2,3]。因此,寻找合适的药物来抑制甚至杀灭引起羔羊腹泻的致病性大肠杆菌成为当前的研究热点。近年来,中药抗菌药物的研究已经成为国内外的研究热点,中药及其复方制剂也作为潜在抗菌药物广泛应用于畜禽的疾病防控中[4,5]。有研究结果显示,蒲公英、黄连、山楂、石榴皮、五味子、芦荟、白头翁、乌梅和香薷等中药对大肠杆菌均具有不同的抗菌活性[6-8]。因此,本试验以从羔羊腹泻临床病例中分离的O78型大肠杆菌作为研究对象,筛选对其具有抗菌作用的中药,并分析部分中药联合后的抑菌效果,期望为抗大肠杆菌药物的研发和临床用药提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验菌株

羔羊腹泻大肠杆菌O78型由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院羊病研究室分离保存并馈赠。

1.1.2主要试剂与药品

大青叶、胖大海、夏枯草、蒲公英、金银花、草豆蔻、板蓝根、白头翁、车前子、藏红花、广藿香、葛根、黄芩、黄柏、黄连、大黄、白芷、川芎、芦根、山药、沙参、石膏、通草、老鹤草、五味子、丁香、当归、秦皮、党参、白术、干姜、苍术、连翘、陈皮、防风、甘草均购自辽宁成大方圆医药连锁有限公司。营养肉汤和营养琼脂均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3主要仪器

电热恒温培养箱(型号为DHP-9162)购自杭州汇尔仪器设备有限公司。超净工作台(型号为BBS-DDC)购自济南鑫贝西生物技术有限公司。全自动高压蒸汽灭菌器(型号为BKQ-B100II)购自山东博科科学仪器有限公司。游标卡尺(型号为0～150 mm)购自温岭市开创量具有限公司。中药材粉碎机(型号为SL-200A)购自浙江省永康市松青五金厂。

1.2 方法

1.2.1中药药液的制备

分别称取经过粉碎后的36种中药粉末50 g,加入500 mL超纯水浸泡1 h后,加热煮沸后文火煎煮至100 mL,纱布过滤,再用400 mL超纯水将滤渣加热煮沸后文火煎煮至100 mL,合并滤液并加热浓缩至50 mL,使36种中药药液的生药浓度为1 g/mL,备用。

1.2.2细菌悬液的制备

将大肠杆菌接种于营养肉汤培养基中进行活化,37 ℃的恒温摇床(160 r/min)中培养24 h。用接种环将活化后的细菌接种到营养琼脂平板上进行纯培养,37 ℃恒温培养箱中培养24 h。在营养琼脂平板上挑取表面光滑、长势较好的单一菌落接种到营养肉汤培养基中进行增菌培养,37 ℃的恒温摇床(160 r/min)中培养24 h。采用平板计数法对增菌后每毫升菌液的活菌数进行测定,并使用营养肉汤将计数后菌液调制成菌液浓度为2.0×108CFU/mL,备用。

1.2.3抑菌试验

参照参考文献[9]中的方法,采用平板打孔法测定单方中药和中药复方制剂的抑菌圈大小。取100 μL菌液浓度为1.0×108CFU/mL的大肠杆菌菌液涂布于营养琼脂培养基上,并使用直径为4 mm的无菌打孔器在每个营养琼脂培养基上进行打孔后,向每个试验孔中加入60 μL的单方中药和中药复方制剂药液,试验孔中的药液应处于满而不溢的状态。将经过上述处理后的营养琼脂培养基置于电热恒温培养箱中进行培养,37 ℃培养24 h后,使用游标卡尺测量抑菌圈大小。每种单方中药和中药复方制剂药液需进行3次重复试验。

抑菌圈判定标准:抑菌圈直径>20 mm,极度敏感(++++);抑菌圈直径15～20 mm,高度敏感(+++);抑菌圈直径10～15 mm,中度敏感(++);抑菌圈直径<10 mm,低度敏感(+);无抑菌圈,不敏感(-)。

1.2.4单方中药的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

取灭菌试管12支,编号依次为1—12,在每支试管中加入2 mL营养肉汤培养基,然后在第1支试管中加入2 mL的受试单方中药药液,混匀后吸取1号试管中的液体2 mL加入第2管中,以此类推,直到第10管中取出2 mL弃去,使1—10号试管的含药浓度分别为500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.813 mg/mL、3.906 mg/mL、1.953 mg/mL和0.977 mg/mL。随后在1—11号试管中加入10 μL菌液浓度2×108CFU/mL的菌悬液,摇匀,第11号试管为阳性对照,第12号试管作为空白对照,37 ℃的恒温摇床(160 r/min)中培养24 h,观察结果。以不发生浑浊变化的最小药物浓度作为单方中药对大肠杆菌的MIC。在测定的MIC值基础上,将不发生浑浊变化试管中的液体培养基接种于营养琼脂培养基上,37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h,观察结果。以菌落数小于5相对应的最小药物浓度作为单方中药对大肠杆菌的MBC。本试验重复3次。

1.2.5中药复方制剂MIC和MBC的测定

参照参考文献[10]中的方法,采用微量肉汤稀释棋盘交叉法测定中药复方制剂对大肠杆菌的MIC。使用营养肉汤培养基将对大肠杆菌具有高度敏感和极度敏感的单方中药分别稀释至药物浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC,并按照微量肉汤稀释棋盘交叉法要求将单方中药进行两两组合,每种单方中药50 μL,配置成中药复方制剂后,加入10 μL菌液浓度为2×108CFU/mL的菌悬液。设置阴性对照和阳性对照。37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察结果。以不发生浑浊变化的最小药物浓度作为中药复方制剂对大肠杆菌的MIC。在测定的MIC值基础上,将不发生浑浊变化试管中的液体培养基接种于营养琼脂培养基上,37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h,观察结果。以菌落数小于5相对应的最小药物浓度作为中药复方制剂对大肠杆菌的MBC。本试验重复3次。

1.2.6双联中药复方制剂分级抑菌浓度(FIC)指数的计算

依据单方中药对大肠杆菌的体外抑菌效果,选取其中对大肠杆菌高度敏感和极度敏感的单方中药进行双联中药复方制剂抑菌效果试验,并根据双联中药复方制剂FIC指数计算公式计算双联中药复方制剂FIC指数。计算公式如下:

FIC=(甲药联用MIC/甲药单用MIC)+(乙药联用MIC/乙药单用MIC)

双联中药复方制剂FIC指数判读标准:当FIC指数<0.5时,两种中药为协同作用;当0.52.0时,两种中药为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 单方中药对大肠杆菌的体外抑菌效果

由表1可知,36种单方中药中有12种单方中药对大肠杆菌具有抑菌效果,其中大肠杆菌对金银花、五味子、白术和大青叶4种单方中药高度敏感;大肠杆菌对大黄中度敏感;大肠杆菌对蒲公英、板蓝根、黄芩、白头翁、黄柏、黄连和车前子7种单方中药低度敏感。大肠杆菌对胖大海、苍术、夏枯草、秦皮、连翘、甘草、草豆蔻、陈皮、防风、白芷、干姜、沙参、党参、当归、广藿香、藏红花、川芎、丁香、芦根、山药、葛根、通草、老鹤草和石膏24种单方中药不敏感。

表1 单方中药对大肠杆菌的体外抑菌效果

2.2 单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC

由表2可知,蒲公英、板蓝根、黄芩、白头翁和黄柏5种单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC分别为250 mg/mL和500 mg/mL;黄连、大黄和车前子3种单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC分别为62.5 mg/mL和125 mg/mL;金银花单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC均为62.5 mg/mL;五味子和白术2种单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC分别为31.25 mg/mL和62.5 mg/mL;大青叶单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC分别为15.625 mg/mL和31.25 mg/mL。

表2 单方中药对大肠杆菌的MIC和MBC

2.3 中药复方制剂对大肠杆菌的MIC、MBC和FIC

由表3可知,金银花+五味子、金银花+白术、五味子+白术、五味子+大青叶和白术+大青叶5种中药复方制剂对大肠杆菌的FIC为1.50,主要表现为无关作用;金银花+大青叶中药复方制剂对大肠杆菌的FIC为0.75,主要表现为相加作用。

2.4 中药复方制剂对大肠杆菌的体外抑菌效果

由表4可知,6种中药复方制剂对大肠杆菌均有较强的抑菌效果,其中大肠杆菌对金银花+大青叶和五味子+大青叶2种中药复方制剂极度敏感;大肠杆菌对金银花+五味子、金银花+白术、五味子+白术和白术+大青叶4种中药复方制剂高度敏感。

表4 中药复方制剂对大肠杆菌的体外抑菌效果

3 讨论

本试验采取传统水煎煮的方法对36种中药中的有效成分进行提取,而后采用平板打孔法和试管二倍稀释法对中药抑菌活性进行测定。结果表明,36种单方中药中的12种对大肠杆菌具有抑菌效果,其中金银花、五味子、白术和大青叶4种单方中药对大肠杆菌的抑菌效果最优。本试验中金银花对大肠杆菌的抑菌圈≥15 mm,MIC与MBC均为62.5 mg/mL,测定结果与郎利敏等[11]报道的金银花对大肠杆菌的抑菌圈≥10 mm,MIC为62.5 mg/mL,MBC 62.5～125 mg/mL的结果存在差异。本试验中五味子对大肠杆菌的抑菌圈≥15 mm,MIC为31.25 mg/mL,MBC为62.5 mg/mL,测定结果与鹿意等[12]报道的五味子对大肠杆菌的抑菌圈≥20 mm,MIC与MBC均为7.812 mg/mL的结果存在差异。本试验中白术对大肠杆菌的抑菌圈≥15 mm,MIC为31.25 mg/mL,MBC为62.5 mg/mL,测定结果与王雅如等[13]报道的白术对大肠杆菌的抑菌圈为9.26 mm,MIC与MBC均为500 mg/mL的结果相接近。本试验中大青叶对大肠杆菌的抑菌圈≥15 mm,MIC为15.625 mg/mL,MBC为31.25 mg/mL,测定结果与张楚贞等[14]和张慧等[15]报道的大青叶对大肠杆菌的抑菌圈>10 mm,MIC为50 mg/mL,MBC>200 mg/mL的结果存在差异。究其原因:(1)金银花中含有的绿原酸和异绿原酸等多种药理活性成分可通过影响大肠杆菌相关代谢酶的活性来抑制大肠杆菌对糖的代谢和破坏细菌细胞壁,进而实现抗菌作用[16];(2)五味子中含有的木脂素类和黄酮类化合物等多种药理活性成分可通过影响大肠杆菌细胞膜的通透性,进而实现抗菌作用[17];(3)白术中的白术多糖、挥发油和黄酮类化合物等多种药理活性成分对大肠杆菌具有较强的抗菌活性,但作用机理不明确,需进一步研究[18,19];(4)大青叶中的黄酮类化合物等药理活性成分对大肠杆菌具有较强的抗菌活性,但作用机理未见报道,抗菌机理的后续研究可能参照其他的黄酮类化合物对大肠杆菌抗菌机理的研究[20];(5)菌株的动物来源、血清型和耐药性及中药产地、质量等不同可能造成抑菌效果的差异[21,22];(6)提取工艺相接近,但工艺参数存在差异可造成抑菌效果差异,如提取温度、水煎液滤过方式等[23,24]。

本试验在进行中药联用对大肠杆菌的抑菌效果研究时,选取36种中药中对大肠杆菌具有高度敏感和极度敏感的中药进行双联中药复方制剂抑菌效果试验。本研究结果表明,金银花+五味子、金银花+白术、五味子+白术、五味子+大青叶、白术+大青叶、金银花+大青叶6种中药复方制剂对大肠杆菌具有较强的体外抑菌作用;金银花+大青叶中药复方制剂对大肠杆菌主要表现为相加作用;金银花+五味子、金银花+白术、五味子+白术、五味子+大青叶和白术+大青叶5种中药复方制剂对大肠杆菌主要表现为无关作用。究其原因:(1)选用较强抑菌作用的单方中药进行双联中药复方制剂抑菌效果试验时,较少出现拮抗作用,大多数会保持无关作用[25];(2)大青叶中含有黄酮类化合物,而黄酮类化合物能使大肠杆菌细胞膜和细胞壁的通透性增加,金银花和大青叶中的抑菌成分更易进入菌体,进而发挥抑菌作用[13];(3)金银花中含有的鞣酸可使大青叶中的抑菌成分易于进入大肠杆菌菌体内部,并不易被主动排出,发挥抑菌作用;(4)金银花中含有的鞣酸为大青叶中的抑菌成分提供适宜溶解的酸性环境,更好发挥药效。