‘粉色记忆’玉簪组培快繁技术初探

陈锦锦，马庆华，凌皖北，周振华，邓瑞来

（安徽开源园林绿化工程有限公司，中煤第三建设集团有限责任公司，安徽合肥 230000）

玉簪（Hosta plantaginea）是百合科玉簪属的多年生宿根植物，具有花叶共赏、类型丰富、耐阴性强等特点，是世界著名的耐阴地被，常作为耐阴植物在景观设计中应用，多植于建筑物北边、公园溪边湖畔岩石旁、疏林下或其他植株荫蔽处等[1]。

现在国际上登录的玉簪园艺栽培品种6 000 余种。玉簪‘粉色记忆’由‘One Man’s Treasure’בSquash Casserole’杂交选育而成，为小型—中型品种，红杆子，叶缘波浪状，叶尖明显，叶片会从黄色—淡黄偏绿转变。近年来，多品种玉簪的离体培养体系已建立，外植体的选择有花序、花蕾、幼芽、子房和花葶等[2-3]，该文采用较易获得且不破坏植株成活的外植体叶片进行‘粉色记忆’玉簪离体培养体系的建立。研究‘粉色记忆’玉簪植物的离体快繁技术，不仅可以丰富皖北地区的玉簪资源，满足市场需求，还可以提供玉簪组培实践依据和理论指导，为筛选优良无性系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自安徽开源园林绿化工程有限公司宿州苗圃科研基地玉簪‘粉色记忆’，剪取幼嫩叶片作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的采集与处理。外植体采集于玉簪‘粉色记忆’春季叶片生长期，剪取幼嫩叶片，在自来水下冲洗30 min后，在超净工作台上先用75%酒精浸泡15 s，再用0.5%二氯异氰尿酸钠溶液外加2～3 滴吐温-20 浸泡，消毒时间分别为10、15、20 min，期间轻轻振荡。消毒处理后的叶片用无菌水冲洗3 次，再用无菌滤纸吸干叶片表面的水分，然后在高温高压灭菌后的培养皿中用手术刀片先将消毒剂接触的叶片边缘切去2～3 mm，再将剩下的叶片切成约1 cm2的小块。平铺接种到愈伤诱导培养基中，每瓶接种5个叶片切块，每个处理重复3 组，每组3 瓶。7 d 后统计外植体成活数量。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基。以MS (Murashige and Skoog)为基本培养基，在前人的研究基础上[3-5]共设计了4 种愈伤组织诱导培养基，分别为A1：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；A2：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；A3：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D；A4：MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D。添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH 调整为5.8。培养基高温高压灭菌后每瓶接种4～6 个叶片切块，每个处理重复3组，每组3 瓶。接种后放入培养箱中进行暗培养，培养温度（25±2）℃。培养出现愈伤后移至光照培养室，光照强度为2 000 lx，光周期14 h/10 h，温度（25±2）℃。60 d 后统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率（%）=诱导出愈伤组织的外植体数量/接种外植体数量×100（1）

1.2.3 愈伤组织增殖培养基。将愈伤组织切成小块接种到增殖培养基中，以MS 为基本培养基，共设计了4 种增殖培养基，分别为B1：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；B2：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA；B3：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；B4：MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH 调整为5.8。培养基高温高压灭菌后每瓶接种3～5 个愈伤组织块，每个处理重复3组，每组3 瓶。接种后进行光照培养，光照强度为2 000 lx，光周期14 h/10 h，温度（25±2）℃。30 d 后统计愈伤组织增殖率。

愈伤组织增殖率（%）=（增殖后质量-增殖前质量）/增殖前质量×100（2）

1.2.4 芽增殖培养基。将带有不定芽的愈伤组织切成单个的芽苗接种到芽增殖培养基中，以MS 为基本培养基，共设计了2 种增殖培养基，分别为C1：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；C2：MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D。添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH 调整为5.8。在玻璃瓶中培养，每个瓶中倒入50 mL 培养基。培养基高温高压灭菌后每瓶接种4～6 个芽苗，每个处理10 瓶。接种后进行光照培养，光照强度为2 000 lx，光周期14 h/10 h，温度（25±2）℃。30 d 后统计芽增殖系数。

芽增殖系数=增殖的丛生芽数/接种芽数（3）

1.2.5 生根培养基。将增殖后的丛生芽分开成单个的小苗接种于生根培养基中，依据前人的研究经验[1，6]以1/2 MS为基本培养基，共设计了2 种生根培养基，分别为D1：1/2 MS+0.1 mg/L NAA 和D2：1/2 MS+0.5 mg/L NAA，添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH 调整为5.8。培养基高温高压灭菌后每瓶接种4～6 个芽苗，每个处理10 瓶。接种后进行光照培养，光照强度为2 000 1x，光周期14 h/10 h，温度（25±2）℃。7 d 开始观察生根情况。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌时间

表1 数据显示，10 min 的灭菌时间外植体成活率最低仅15.5%，污染率高达84.5%。20 min 的灭菌时间导致部分组织被杀死，叶片慢慢褐化无法诱导愈伤组织，成活率在31.1%。灭菌15 min 大部分叶片可以保持活性且污染率低，成活率在88%以上，所以玉簪‘粉色记忆’叶片最佳的灭菌方法为0.5%二氯异氰尿酸钠溶液浸泡15 min。

表1 外植体消毒时间选择

2.2 诱导培养基

观察4 种培养基诱导愈伤组织情况（图1），A1 培养基中叶片培养30 d 边缘出现白色松散物质，但是后期无其他明显变化，未进一步分化。A2 培养基中叶片大部分褐化丧失活力，培养40 d 左右有极少叶片可以诱导出淡黄色愈伤组织，培养60 d 愈伤组织进一步增殖扩大。A3 培养基中叶片微微向上拱起，但是未诱导出愈伤组织。A4 培养基中叶片培养30 d 切口附近开始出现淡黄色的颗粒状愈伤组织，培养45 d 左右愈伤组织开始分化胚状体，甚至有根的再生，愈伤组织体积继续增大。培养60 d 部分愈伤组织开始有芽的再生。

图1 ‘粉色记忆’玉簪叶片愈伤组织诱导培养

从表2 可以更直观地看出A1 和A3 培养基无法诱导出愈伤组织，A2 培养基诱导率较低，为10.9%，A4 培养基诱导率为68.3%，更适合‘粉色记忆’玉簪愈伤组织的诱导。

表2 不同激素组合对‘粉色记忆’玉簪叶片愈伤组织诱导的影响

2.3 愈伤组织增殖培养基

‘粉色记忆’玉簪叶片诱导培养基虽然能形成愈伤组织，但诱导率相对较低。为快速获得足够数量的愈伤组织，需进行增殖培养。培养1 个月后，愈伤组织在这些培养基上均实现了不同程度的增殖。表3 数据显示，B1、B2培养基愈伤组织增殖率低于B3 和B4 培养基，说明6-BA是愈伤增殖的重要激素。B2 和B4 培养基中愈伤组织虽然能够快速增殖达到较高的增殖率，其中B4 培养基增殖率达到200%，但在增殖过程中再生出很多根，很少有芽再生，而B1 和B3 培养基能较快诱导出多数不定芽（图2），说明在愈伤组织增殖培养基中NAA 浓度不易过高，否则不利于进一步分化。因此B3 培养基更适合‘粉色记忆’玉簪愈伤组织增殖和不定芽诱导。

图2 ‘粉色记忆’玉簪叶片愈伤组织增殖培养

图3 ‘粉色记忆’玉簪芽增殖培养

表3 不同激素组合对‘粉色记忆’玉簪叶片愈伤组织增殖的影响

2.4 芽增殖培养基

从表4 可以看出，不同激素组合的培养基‘粉色记忆’玉簪芽都会产生增殖。C1 培养基中芽增殖系数为2.34，相对较低，幼苗生长缓慢，长势较弱。C2 培养基中芽增殖系数为3.3，显著高于C1 培养基，其接种10 d 左右，基部腋芽开始萌动产生突起，幼苗生长较快，长势良好，然而根系较少。这表明‘粉色记忆’玉簪芽增殖对激素的适应范围比较广，从芽增殖培养来看，1.0 mg/L TDZ 和1.0 mg/L 2，4-D 是更为理想的激素组合，这和愈伤组织诱导的激素相同。

表4 不同激素组合对‘粉色记忆’玉簪芽增殖的影响

2.5 生根培养基

该研究中2 种不同激素组合的培养基‘粉色记忆’玉簪芽苗都会生根，但根系状态有所不同。接种7 d 后观察添加0.1 mg/L NAA 生根数量更多，生长速度更快（图4），添加0.5 mg/L NAA 生根数量少且生长较慢，说明NAA 浓度较高不利于快速生根。因此0.1 mg/L NAA 激素含量更适合‘粉色记忆’玉簪芽苗进行生根培养。

图4 ‘粉色记忆’玉簪芽生根培养

3 结论

该研究选择叶片作为建立‘粉色记忆’玉簪组培快繁体系的外植体，与其他外植体相比取材时间相对不受限，且材料充足。外植体最佳效果的灭菌方法是采用0.5%二氯异氰尿酸钠溶液外加2～3 滴吐温-20 消毒15 min，对外植体的伤害较小且不易生菌。6-BA、NAA、2，4-D、TDZ 等是外植体诱导愈伤组织所常采用的激素，前人研究中常见激素组合为6-BA 和NAA[7]，该研究发现，‘粉色记忆’玉簪叶片愈伤组织的诱导在2，4-D 和TDZ 激素配比的培养基中愈伤诱导速度更快且诱导率相对较高。愈伤组织增殖培养基中激素组合6-BA 1.0 mg/L 和NAA 1.0 mg/L 增殖率高且诱导不定芽较多。然而值得关注的是在芽增殖的激素组合中2，4-D 和TDZ 又是最佳配比的培养基，增殖系数最高且芽苗长势更好。生根培养基中1/2 MS 培养基添加0.1 mg/L NAA 更适合‘粉色记忆’玉簪芽苗的生根培养。