细柱西番莲高效再生体系的建立

解贻龙，陈巧玲，吴菁华*

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州 350002；2.福州绿榕园林工程有限公司，福建福州 350000）

西番莲科（Passifloraceae）有18 个属630 多种植物，西番莲属（Passiflora）约有500 多种，多分布在北美和南美，拥有超过95%的西番莲科植物[1]。西番莲花5 瓣，两性花，辐射对称，花被明显，花萼和花瓣形状和大小不同。花瓣通常是膜质的，在花萼管的边缘发育，西番莲花都有一个雌雄蕊柄，将5 个融合的雄蕊提升到基部，并与由3 个融合心皮组成的雌蕊群相[2-3]。不同西番莲属植物在叶、果实和花等形态特征上差异较大，用途也各不相同。部分西番莲属植物的果实可以作为水果食用；一部分西番莲植物的叶或花的提取物也可以用在医药、化妆品等产品中；有一部分类型具有很高的观赏价值，被开发作为园林观赏植物[2]。

细柱西番莲（Passiflora suberosa L.）广泛分布于西印度群岛、墨西哥和南美洲中部地区[2]。在我国台湾、云南、福建等地有分布[4]，常作为观赏植物，也可用作镇静剂，用于治疗高血压、糖尿病和皮肤病[4-5]。植物高效再生体系是植物快繁、诱变、倍性及基因工程育种的基础。西番莲属植物组织培养的报道较多[6]，国内主要以食用西番莲为主[7-9]。该文以福建省野生细柱西番莲为材料，探索高效再生体系，为细柱西番莲的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

将细柱西番莲种子消毒后播种在MS 培养基中，待苗高约4 cm 时，选取真叶、叶柄和带节的茎段用于组织培养。

1.2 愈伤组织与不定芽诱导

将叶片剪切至直径为1 cm 左右大小的三角形，叶柄切至1 cm 长，用于诱导愈伤和诱导丛生芽。诱导愈伤培养基和诱导丛生芽的培养基为MS+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂7 g/L+6-BA（0、0.5、1.0、2.0 mg/L）。每瓶接种2 个外植体，每次接种10 瓶，重复3 次。接种后7 d 统计污染率，15 d统计死亡率、褐化率，30 d 统计愈伤组织诱导率，继代培养30 d 统计不定芽诱导率和增殖系数。

死亡率（%）=死亡数/接种总数×100；

愈伤组织诱导率（%）=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数×100；

不定芽诱导率（%）=诱导出芽的外植体数/接种的外植体总数×100；

芽增殖系数=分化出芽的数量/诱导出芽的外植体数。

1.3 带芽茎段诱导不定芽

每个茎段保留1 个芽点，水平接至培养基中，培养基使用MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+6-BA（0、1.0、2.0 mg/L），30 d 统计存活率、增殖率。

死亡率（%）=死亡数/接种总数×100；

增殖率（%）=分化出芽的数量/接种总数×100。

1.4 壮苗生根

将诱导出的小芽分别接种在添加不同浓度的IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和1 g/L 活性炭的1/2MS 培养基中。为比较MS 和1/2MS 培养基对细柱西番莲生根的影响，也将小芽接种在MS+活性炭1 g/L+IBA 1.0 mg/L 的培养基中。每处理接种5 瓶，每瓶3 个小芽。每隔3 d 统计生根情况，30 d 时观察植株表现并统计生根率。

生根率（%）=生根植株数/接种总数×100。

1.5 炼苗移栽

待组培苗长至3～4 cm 高时，选取长势健壮、根系发达的再生苗进行炼苗移栽。先在组培室中打开瓶盖放置2～3 d。从组培瓶中取出组培苗后用自来水将根部的培养基冲洗干净，移栽至草炭土∶珍珠岩∶蛭石=3∶1∶1 的基质中。移栽后浇透水，适当通风并保持空气湿度，每天对叶面喷水保湿，待有新芽生长后转至户外正常管理，统一水肥管理。每次移栽10 棵，重复3 次。

成活率（%）=成活数/炼苗总数×100。

2 结果与分析

2.1 细柱西番莲愈伤组织及不定芽诱导

2 种外植体在不加激素的培养基中表现相似，没有诱导出愈伤组织，外植体逐渐死亡（图1A），叶柄的褐化及死亡率较真叶小。从表1 可以看出，加入6-BA 后促进了细柱西番莲愈伤组织和不定芽的分化，1 mg/L 6-BA 促进愈伤组织分化的效果较好，真叶和叶柄的分化率分别达到93.33%和95%。叶柄的伤口部位产生大量愈伤，且在培养的第30 d 产生肉眼可见的不定芽（图1B），而真叶则在第25 d 分化出小芽（图1C）。当6-BA 提高到2 mg/L 时，愈伤诱导率与1 mg/L 相近，但是愈伤组织生长减缓，30 d 统计时未见不定芽的分化。

表1 不同浓度6-BA 对真叶和叶柄愈伤组织诱导的影响

从表2 可以看出，愈伤组织进行继代培养30 d 后发现除没有添加激素的MS 培养基外，其他培养基均能诱导产生不定芽，接种在添加6-BA 培养基中的外植体均有不定芽产生。当6-BA 浓度在1 mg/L 时，叶柄（图2A）和真叶（图2B）分化率最高，分别为33.33%和51.67%，增殖系数分别为2.86 和5.10。随着6-BA 浓度的上升，真叶及叶柄的分化率下降，增殖系数也显著下降。

图2 叶柄和真叶诱导的愈伤组织分化不定芽

表2 不同部位在不同培养基中分化结果

2.2 带芽茎段诱导不定芽

将带芽茎段分别接种在不添加6-BA 的培养基中，芽点正常生长，叶片绿色加深，植株生长健壮，但几乎不会发生增殖，也没有生根（图3A）。芽点在添加1 mg/L 6-BA的MS 培养基中分化出大量新芽，并能正常伸长，在带芽茎段两端分化愈伤组织（图3B），此时带芽茎段的增殖率也最高，达5.99%。当6-BA 浓度增加到2 mg/L 时，带芽茎段也能分化出不定芽，但植株叶片偏小，生长势偏弱，节间短，并出现部分新枝条死亡的现象（图3C）。

图3 带芽茎段在不同培养基中诱导不定芽

2.3 生根培养

从表3 可以看出，将大小一致的不定芽接种到生根培养基后定期观察，小苗大约在16 d 后开始长根，培养30 d 后对根和植株的生长情况进行统计。比较1/2 MS 和MS 培养基对细柱西番莲生根的影响，发现MS 培养基较1/2MS 好，生根率高，根的发育也更好。将分化的不定芽接种在含有不同浓度IBA 的MS 培养基上，发现添加1 mg/L IBA 培养基的细柱西番莲的生根率最高，植株和根的生长状态也最好（图4）。因此，MS+1 mg/L IBA 适合细柱西番莲的生根培养。

图4 细柱西番莲生根培养

表3 不同培养基对生根的影响

2.4 炼苗移栽

将株高约3～4 cm 的再生小植株先在培养室中根据扦插时进行的基质筛选，细柱西番莲在草炭土∶珍珠岩=3∶1 的基质中移栽，表现较好，移栽成活率达到83.33%（图5）。

图5 移栽

3 结论与讨论

目前已经利用西番莲不同类型的外植体，如叶片、根、下胚轴、茎节、节间节、叶柄和卷须建立再生体系，叶片、下胚轴、根段、子叶和胚乳均可以诱导形成不定芽[10-12]。不同外植体诱导不定芽需要的激素不同：下胚轴和子叶在添加1.0 mg/L BA 的MS 培养基中，诱导形成不定芽的频率最高；真叶和胚乳的最佳浓度为2.0 mg/L BA；根段需要1.0 mg/L KIN 才能较好地诱导不定芽[13]。Guzzo 等人对62种西番莲合子胚进行培养，有29 种产生了愈伤组织，13种西番莲的愈伤组织成功地再生了植株[14]。该试验利用细柱西番莲的真叶和带芽茎段都能诱导不定芽，这与其他西番莲的研究结果比较类似，表明西番莲属植物不同外植体都具有较好的脱分化和再分化能力。

在组织培养中，获得不定芽的途径主要有2 条：直接器官发生型和间接器官发生型。在西番莲属植物的组织培养中利用这2 条途径均可以获得不定芽。西双版纳西番莲在添加6-BA 和NAA 和1/2 MS 培养基上，可诱导愈伤组织诱导和不定芽[15]。龙珠果在低浓度的6-BA 和NAA 的MS 培养基上有利于诱导丛生芽并促进芽的生长，而在高浓度的6-BA 和NAA 的MS 培养基上有利于诱导愈伤组织[16]。

西番莲的再生还可以通过体胚发生途径产生。目前发现西番莲的根和成熟合子胚均可以作为体细胞胚胎发生的外植体，但成熟合子胚诱导的研究较根多，已在多种西番莲中获得成功[17-18]。P. foetida、P. giberti 和P.cincinnata的成熟合子胚都可以诱导体胚产生[19]。P. cincinnata 体细胞胚胎发生需要有较高浓度的2，4-D 和6-BA。然而，P. suberosa 的合子胚在相同的条件下培养仅观察到不定芽的形成[19]。因此，不同西番莲的体胚再生体系还需要更多的研究。

激素类型和浓度是影响植物组织培养的主要因素之一。在西番莲属植物的组织培养中，常用到的细胞分裂素有6-BA、2，4-D、TDZ 和KIN，生长素有IAA 和NAA，有一些种类还用到了GA3[6]。在西番莲属的组织培养中，有多种类型只用6-BA 或者6-BA 与TDZ 或KIN 组合，就能诱导愈伤组织和不定芽，如P.caerulea 的带芽茎段和P.cincinnata的根在添加4.44 μM 6-BA 的培养基中诱导不定芽，可作为后续试验的参考[20-21]。