酶法在不同乳制品乳果糖检测中的应用研究

叶巧燕，常嵘，刘慧敏，郭洪侠，迟雪露，宫慧姝，郑楠

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193；2.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；3.甘州区动物卫生监督所，甘肃 张掖 734000）

0 引 言

乳果糖(4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-fructose)又称乳酮糖，是液态奶经热加工后，乳糖在酪蛋白的游离氨基集团的催化条件下碱基异构化而形成的一种双糖[1-3]。乳果糖不是天然存在于生乳中的，不同的加热处理方式产生的乳果糖含量不同，乳果糖的含量与热加工程度成正比[4]。因此，乳果糖可作为判断液态奶热加工方式的重要指标，评价巴氏杀菌乳、灭菌乳和乳粉的热处理强度[5-8]，或用于鉴定复原乳[9]。

检测乳果糖的方法主要有酶法、高效液相色谱法、离子色谱法等[10-11]，其中，酶法是基于酶促反应动力学原理，将牛奶经过β-D-半乳糖苷酶水解后产生半乳糖和果糖，通过测定产生的果糖来计算乳果糖含量[12]。因酶法具有准确、稳定、检出限低（4.2 mg/L）的优点，在巴氏杀菌乳、灭菌乳及复原乳上具有广泛应用，但是否适用于生乳、高温杀菌乳、特色乳、特色乳粉、婴幼儿配方粉等不同乳制品中乳果糖含量的测定需要进一步试验验证。因此，本研究使用酶法对特色乳、婴幼儿配方粉等不同乳制品中乳果糖检测的准确度和精密度进行试验，验证酶法在检测不同乳制品中乳果糖的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碳酸氢钠（NaHCO3)、硫酸锌（ZnSO4·7H2O)、亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]·3H2O）、氢氧化钠（NaOH）、硫酸铵（(NH4)2SO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2HPO4）、硫酸镁(MgSO4·7H2O) 、辛醇（C8H18O），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；三乙醇胺盐酸盐[N(CH2CH2OH)3HCl]，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；过氧化氢（H2O2，质量分数：30%），分析纯，德国MERCK 公司；5’-腺苷三磷酸二钠盐（C10H14N5Na2O13P3）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠（C21H26N7Na2O17P3），分析纯，美国SIGMA 公司。

β-D-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）源自米曲霉（Aspergillus oryzae），活性≥8 U/mg；葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）源自黑曲霉（Aspergillus niger），活性≥100 U/mg；过氧化氢酶（EC 1.11.1.6）源自牛肝脏（bovine liver），活性≥40 000 U/mg，protein 浓度≥14 mg protein/mL；己糖激酶（EC 2.7.1.1）/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC 1.1.1.49）源自面包酵母(Baker's Yeast)，活性≥170 U/mg；磷酸葡萄糖异构酶（EC 5.3.1.9）源自面包酵母(Baker's Yeast)，活性≥560 U/mg，protein 浓度为≥8.0 mg protein /mL；以上酶制剂均来自美国SIGMA 公司。

巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、灭菌乳、复原乳、全脂乳粉、婴幼儿配方粉（一段婴幼儿配方粉、二段婴幼儿配方粉，以下简称一段、二段）和特色乳制品灭菌羊奶、灭菌驼奶、灭菌水牛奶、灭菌牦牛奶、羊乳粉、驼乳粉、配方羊奶粉，市售。

U-3900 紫外分光光度计，日本HITACHI 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品检测

1.2.1.1 沉淀蛋白

分别选取生乳、巴氏杀菌乳、灭菌羊奶、全脂乳粉等10 种不同乳制品，粉状样品用温水10 倍复溶后使用。向120 mL 样品瓶中依次加入样品20 mL、蒸馏水20 mL、130 g/L 亚铁氰化钾溶液7 mL、168 g/L 硫酸锌溶液7 mL 和pH7.5 磷酸盐缓冲液A 26 mL 震荡混匀后静置10 min，过滤收集滤液。

1.2.1.2 水解乳糖、乳果糖

吸取5.00 mL 滤液置于10 mL 刻度试管中加入1 890 U/mLβ-D-半乳糖苷酶溶液200 μL 混合均匀后加盖，将其放入50 ℃培养箱内培养1 h，同时做空白试验，空白试液中不加β-D-半乳糖苷酶溶液。

1.2.1.3 葡萄糖氧化

在水解后的试液中依次加入2 mL pH7.5 三乙醇胺盐酸盐-硫酸镁缓冲液C 4 000 U/mL 葡萄糖氧化酶溶液100 μL、辛醇1 滴、0.33 mol/L 氢氧化钠溶液0.5 mL 和过氧化氢50 μL、1 300 000 U/mL 过氧化氢酶悬浮液50 μL。每加入一种试剂后都充分混匀，随后将样品放入40 ℃培养箱内培养3 h。培养结束后放入室温冷却后用水定容至10 mL，过滤收集滤液。

1.2.1.4 测定

在比色皿中依次加入pH7.6 三乙醇胺盐酸盐-硫酸镁缓冲液B 1.00 mL、50 g/L ATP 溶液0.10 mL、10 g/L NADP 溶液0.10 mL、滤液（1.2.1.3）1.00 mL、水1.00 mL，混合均匀后，静置3 min，加入280 U/mL 己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液20 μL，混合均匀，反应5 min 后，置于分光光度计上340 nm 处进行测定，记录吸光值As1。继续加入700 U/mL 磷酸葡萄糖异构酶悬浮液20 μL，混合均匀，反应5 min 后，记录吸光值As2。

1.2.2 试验设计

1.2.2.1 准确度试验

分别对生牛乳、高温杀菌牛乳等4 种液态乳，及全脂乳粉、婴幼儿配方粉等5 种乳粉进行加标回收率试验，选3 个不同水平的加标量，计算回收率和相对标准偏差，据此得到试验的准确度。

1.2.2.2 精密度试验

分别对生牛乳、高温杀菌牛乳等4 种液态乳，及全脂乳粉、婴幼儿配方粉等5 种乳粉进行精密度试验，每个样品重复测定6 次，计算平均值和相对标准偏差，据此得到试验的精密度。

1.2.2.3 实际样品应用

采用酶法对巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、灭菌乳、特色乳、乳粉、配方粉和特色乳粉等118 批次实际样品中的乳果糖含量进行测定，验证该方法的实际应用效果。

1.2.3 数据处理

使用SPSS 软件对数据进行计算分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型乳制品中的乳果糖检测方法学验证

2.1.1 准确度试验

本试验对生牛乳、高温杀菌牛乳、灭菌羊乳、灭菌骆驼乳4 种液态乳进行加标回收率试验，根据每个样品的本底含量在其基础上分别进行高、中、低3 个浓度水平的加标，每个浓度水平进行5 个平行样品测定，计算平均回收率和相对标准偏差，结果如表1。样品加标回收率为94.3%～108.4%、相对标准偏差（RSD）为0.1%～13.4%，符合方法学验证的要求。表明酶法检测生牛乳、高温杀菌牛乳、羊乳、骆驼乳中乳果糖的准确度高。

本试验对全脂乳粉、婴幼儿配方粉、羊乳粉、驼乳粉、羊乳配方粉5 种乳粉及配方粉进行加标回收率试验，根据每个样品的本底含量在其基础上分别进行高、中、低3 个浓度水平的加标，每个浓度水平进行5个平行样品测定，计算平均回收率和相对标准偏差，结果如表2。样品加标回收率为93.7%～109.7%、相对标准偏差（RSD）为0.1%～6.3%，符合方法学验证的要求。表明酶法检测全脂乳粉、婴幼儿配方粉、羊乳粉、驼乳粉、羊乳配方粉中乳果糖的准确度高。

表2 乳粉样品试验结果 mg/kg

2.1.2 精密度试验

本试验分别选取生牛乳、高温杀菌牛乳、羊乳、骆驼乳4 种液态乳进行精密度试验，每个样品重复测定6 次，计算平均值和相对标准偏差，结果如表3 所示。含量范围处于检出限水平的生乳样品的相对标准偏差较大（13.9%）。高温杀菌牛乳、羊乳、骆驼乳样品中乳果糖检测的RSD 为1.3%～4.0%，精密度符合方法学验证要求，表明酶法用于检测生牛乳、高温杀菌牛乳、羊乳、骆驼乳中的乳果糖具有较好的精密度。

表3 液态样品试验结果 mg/L

本试验分别选取全脂乳粉、婴幼儿配方粉、羊乳粉、驼乳粉、羊乳配方粉5 种乳粉进行精密度试验，每个样品重复测定6 次，计算平均值和相对标准偏差，结果如表4 所示。样品检测RSD 为1.1%～6.3%，符合方法学验证的要求。表明酶法检测全脂乳粉、婴幼儿配方粉、羊乳粉、驼乳粉、羊乳配方粉的精密度高。

表4 乳粉样品试验结果 mg/kg

2.2 实际样品应用

从市场上随机选取不同品牌规格的118 批次巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、灭菌乳、特色乳、乳粉、配方粉和特色乳粉的实际样品进行试验。检测结果如图1 所示，不同类型乳制品中乳果糖的平均值从低到高依次为：巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、乳粉、灭菌乳、特色乳、特色乳粉、配方粉，其中灭菌乳中乳果糖的含量显著高于巴氏杀菌乳，结果与其他研究结果一致[13]。巴氏杀菌乳、灭菌乳的加工温度分别为72～85 ℃、135～150 ℃，表明随着热加工温度的变化，乳果糖含量也会发生变化。特色乳、特色乳粉中乳果糖含量差异较大且偏高，说明特色乳及特色乳粉在生产加工过程中可能存在过热现象，加工工艺没有标准化。婴幼儿配方粉的乳果糖含量高于全脂乳粉，一方面是因为配方粉中添加了较多食品添加剂和营养强化剂，导致本底含量高。另一方面是因为在婴幼儿配方粉生产过程中经历的热处理比全脂乳粉更强烈[14]。

图1 不同类型乳制品乳果糖含量范围

3 结 论

本试验使用酶法对不同乳制品中乳果糖检测的准确度和精密度进行试验，结果显示酶法同样适用于生牛乳、高温杀菌乳、特色乳、乳粉和配方乳粉等乳制品中乳果糖的测定，且不同乳制品中乳果糖的含量有较大差异，其中特色乳及特色乳粉中乳果糖含量较高、说明特色乳及特色乳粉可能存在过热加工现象。综上所述，本试验拓宽了酶法测定乳制品中乳果糖的适用范围，为高温杀菌乳、特色乳、乳粉及婴幼儿配方粉的加工工艺评价提供了依据，也为制订乳果糖检测标准提供了数据支撑。