2020-2021年贵德县喜马拉雅旱獭血清中特异性鼠疫噬菌体抗体的检测

李 胜,李广辉,张晓璐,马 龙,游陪松,杨建国,李 翔,金 泳,靳 娟,李存香

(青海省地方病预防控制所,青海 西宁 810021)

噬菌体是寄生于细菌的病毒,是地球上最具有生物多样性的生命体,凡是有细菌的场所就可能有相应噬菌体的存在[1]。噬菌体与细菌的寄生关系主要取决于噬菌体所吸附的器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。通常噬菌体对受体的识别具有很大的特异性,因此噬菌体的宿主范围往往受到细胞表面可用受体的限制[2]。鼠疫噬菌体是一种对鼠疫耶尔森菌具有很强特异性的细菌病毒,如果在样本中检出鼠疫菌特异的噬菌体,则提示样本中可能存在鼠疫菌或不久前曾被鼠疫菌感染过。鼠疫噬菌体具有抗原特异性,能刺激机体产生一种中和抗体,从而抵抗鼠疫菌的感染。国内研究者曾发现,被检样本中存在鼠疫噬菌体会影响鼠疫菌的分离,但在培养基中加入抗鼠疫噬菌体血清后能实现鼠疫菌的分离,说明抗体的保护能力与其中和活性有关[3]。喜马拉雅旱獭作为青藏高原鼠疫自然疫源地的主要宿主,对鼠疫菌具有高度的易感性,且在维持鼠疫自然疫源性和保持延续上起主要的或决定性的作用[4]。1954年5月,在青海省海南州贵南县常牧乡喜马拉雅旱獭体内检出鼠疫菌,证实青海省海南州存在鼠疫疫源地[5]。海南藏族自治州贵德县于1970年和1971年检出鼠疫菌,之后再未分离到鼠疫菌,说明该鼠疫疫源地内动物间鼠疫疫情由活跃期转入静息状态[6,7]。研究发现,静息多年的疫源地一旦转入活跃期,很有可能引发重大公共卫生事件。因此,贵德地区的鼠疫监测工作仍不容忽视。本研究以实验室鼠疫诊断噬菌体和青海地区分离的野生型鼠疫噬菌体为抗原,间接检测青海省贵德县鼠疫疫源地148份喜马拉雅旱獭血清中的特异性鼠疫噬菌体抗体,为及时掌握鼠疫疫源地内动物间鼠疫流行动态和鼠疫防控工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验菌株 试验用鼠疫疫苗株EV76由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。

1.1.2鼠疫噬菌体 试验用噬菌体为鼠疫诊断噬菌体,其效价为10-9(批号:2022—1),由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室制备。野生型鼠疫噬菌体476号分离自天峻县鼠疫疫源地喜马拉雅旱獭肠道内容物。

1.1.3血清来源 被检血清均为喜马拉雅旱獭血清,于2020—2021年7-9月采集自青海省贵德鼠疫疫源县,共计148份。对照血清为抗鼠疫噬菌体血清,由青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科制备。

1.1.4培养基 LB 培养基(固体、液体、半固体)、噬菌体保存液(SM缓冲液)由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。

1.2 方法

1.2.1被检血清制备与检测 将148份喜马拉雅旱獭全血进行5 000×g离心10 min,分离血清后低温分装。所有血清经56℃灭活30 min,采用鼠疫间接血凝试验(IHA)检测鼠疫F1抗体[8],结果均为阴性。

1.2.2菌液制备 取100 μL EV76菌悬液接种于LB液体培养基中,经28℃空气浴振荡培养箱培养18～20 h至对数生长期,将其作为宿主菌。

1.2.3鼠疫噬菌体免疫抗体的检测

1.2.3.1鼠疫噬菌体与被检血清的中和试验 将鼠疫诊断用噬菌体和476号野生型鼠疫噬菌体分别按照10倍梯度稀释至10-5。取40 μL鼠疫噬菌体和等量的被检血清置于无菌96孔微量板中,混匀后用96孔板封板膜封口,置于37℃恒温培养箱孵育24 h。

1.2.3.2鼠疫噬菌体抗体验证试验 将LB固体培养基分为9分格并分别标记血清样本编号。取200 μL对数生长期鼠疫疫苗株EV76菌悬液加入6 mL 45℃的LB半固体培养基中,缓慢混匀后倒入已标记编号的LB固体培养基中。待琼脂凝固后,分别取孵育24 h的中和反应培养液15 μL,点滴于对应标记的培养基分格内,依次完成所有被检样本的点滴试验。每份血清样本点滴2份,分别置于28℃和37℃恒温培养箱中,24 h后观察有无噬菌斑。若出现噬菌斑,说明该样本中不含有特异性的鼠疫噬菌体抗体,反之则说明该样本中含有特异性鼠疫噬菌体抗体。

2 结果

以鼠疫诊断噬菌体和野生型鼠疫噬菌体476号作为抗原,对海南州贵德县鼠疫疫源地的148份喜马拉雅旱獭血清进行特异性鼠疫噬菌体抗体检测,用以上2种鼠疫噬菌体与被检血清分别作用24 h后,经双层琼脂法检测发现,置于28℃和37℃培养的所有培养板上均出现一致的噬菌斑,说明148份喜马拉雅旱獭血清中均未检出特异性鼠疫噬菌体抗体(见图1)。

图1 贵德县鼠疫疫源地喜马拉雅旱獭血清分别与2株鼠疫噬菌体中和作用后的试验验证结果

3 讨论

噬菌体是寄生于细菌的病毒,大量存在于哺乳动物的肠道、皮肤和血液等组织中[9]。噬菌体在宿主动物体内的持续时间及浓度很大程度上取决于易感细菌的侵染[10]。噬菌体进入机体后可以通过吞噬作用和细胞因子反应调节先天免疫,也可通过影响抗体的产生和效应极化来影响适应性免疫[11]。细菌在与噬菌体相互作用的过程中,为了对抗噬菌体的感染,发展出了相应的防御机制。噬菌体主要由蛋白质外壳和包含于其中的核酸(DNA或RNA)所组成,接受噬菌体治疗或暴露于天然噬菌体的个体中容易产生中和抗体。研究者曾在人、小鼠、马等物种的血清中检测到了针对天然噬菌体的噬菌体中和抗体[12-14]。王洪喜[15]用鼠疫噬菌体、抗鼠疫血清及抗鼠疫噬菌体血清等近似自然的诱变因素,通过人工传代方法对鼠疫强毒菌株进行诱变,获得了非典型鼠疫菌,认为鼠疫自然疫源地有可能存在多种形式的非典型鼠疫菌。在动物鼠疫流行末期,由于宿主动物抗性增高,易于检出携带抗鼠疫噬菌体的非典型鼠疫菌[16]。

自然界中的噬菌体种类多样,根据其繁殖特点可分为烈性噬菌体与温和噬菌体。鼠疫诊断噬菌体属于烈性噬菌体,在鼠疫菌体内以裂解方式增殖,产生大量子代噬菌体[17]。野生型鼠疫噬菌体476属于温和性噬菌体,也能裂解鼠疫菌。本试验以鼠疫诊断噬菌体和野生型鼠疫噬菌体作为抗原,与海南藏族自治州贵德县鼠疫疫源地内分离的148份喜马拉雅旱獭血清进行中和反应,利用微量点滴法检测被检血清中的特异性噬菌体中和抗体。结果显示,148份喜马拉雅旱獭血清中均未检出特异性鼠疫噬菌体抗体。鉴于该疫源地已长达几十年未分离到鼠疫菌,可以推测该疫源地动物间鼠疫疫情处于微弱流行或静息状态。有研究发现,抗鼠疫噬菌体菌株毒力较弱有利于宿主动物的生存和繁衍,动物间的鼠疫也可以弱毒的形式延续、循环或在一定范围内潜伏[14]。抗鼠疫噬菌体菌株的特性一旦发生变异,其对动物的毒力会随之增强,极易引发动物间鼠疫疫情的猛烈流行。这种非典型鼠疫菌常常在宿主动物体,特别是有一定抗性和鼠疫免疫体存在的宿主动物及媒介蚤、蜱等体内循环[18]。本研究利用微量法检测贵德县鼠疫疫源地主要宿主——喜马拉雅旱獭血清中的特异性鼠疫噬菌体抗体,有利于间接掌握鼠疫疫源地内动物间鼠疫疫情流行动态,防止突发公共卫生事件的发生。因此,今后应扩大鼠疫监测范围和监测对象,同时采用更先进的检测技术时刻监测该疫源地动物间的鼠疫疫情动态。

2000年后海南藏族自治州共发生了2起人间鼠疫,其中,2009年在兴海县发生的1起肺鼠疫疫情发病12人,死亡3人,对青海省的经济和社会发展造成了巨大影响[19]。通过该地病原学检测发现,该疫源地鼠疫菌具备青藏高原鼠疫疫源地病原体特性,毒力强,人间感染病例多为重症型,易引起传播流行[20]。贵德县具有丰富的旅游资源,随着该地区交通的日益便利、旅游业的发展及务工人员流动性的不断增大,鼠疫远距离传播的风险依然存在。因此,对于处于静息期的疫源地,仍应加大鼠疫监测及检测力度,及时掌握该地区的鼠疫流行态势,严防人间鼠疫疫情的发生。