黄连解毒汤对产金属酶铜绿假单胞菌耐药性的体外逆转作用

李永伟 王春霞 刘心伟 费冰

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）引起的感染很常见，死亡率高，易引起院内感染[1]。近年来，PA 耐药问题愈发严重，而对碳青霉烯类药物的耐药率也在迅速上升[2，3]。因此，世卫组织将耐碳青霉烯类PA 指定为三种关键重点病原体之一[4]。使PA 对碳青霉烯类药物产生耐药性的原因之一是金属β-内酰胺酶，简称金属酶，其编码的基因通过染色体编码或者质粒介导传递耐药基因[5，6]。以质粒为介导的耐药以R 质粒最常见，R 质粒存在于革兰氏阴性菌中，可携带耐药基因，在细菌间移动[7]。通过消除R 质粒，阻止耐药基因传递，使PA恢复部分或者全部对抗生素的敏感性，对于临床治疗多重耐药菌感染及防止耐药菌传播具有重要意义。目前已明确的金属酶化学抑制剂主要有乙二胺四乙酸盐、2-巯基丙酸、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）等药物，但上述药物可广泛与人体内金属离子结合，危害较大，因此尚无法应用于临床治疗[8]。

现代药理学研究发现，黄连解毒汤“清热”效果显著，具有确切的抗炎症反应作用，对脓毒症、全身炎症反应综合征和内毒素血症具有显著的治疗作用[9～11]。研究表明黄连解毒汤可以有效抑制PA 的生长[12]，但目前对黄连解毒汤是否能作为金属酶抑制剂，消除R 质粒，恢复细菌对抗生素敏感性的研究还较为缺乏。因此本研究首先从我院筛选出产金属酶PA，然后通过产金属酶PA 质粒接合转移试验，确定菌株是否存在R 质粒，最后观察黄连解毒汤对R 质粒的消除效果，为探究黄连解毒汤的抗菌机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株PA 均来自我院微生物室分离的各临床标本，通过药敏试验筛选出耐碳青霉烯类PA进行后续试验。质粒接合转移实验受体菌为对叠氮钠耐药、对亚胺培南敏感的J53 大肠埃希菌，由我院检验科保存。

1.2 主要仪器及设备CO2培养箱（赛默飞世尔科技公司）、隔热式电热恒温培养箱（上海恒跃）、NS-100B 台式空气浴恒温摇床（上海皓庄）、黄连解毒汤（河南省中医院中药房）、LB 肉汤（上海生工）、亚胺培南（Imipenem，IPM）药敏纸片（10μg）（英国Oxiod 公司）、亚胺培南标准品（上海阿拉丁）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2，BBI 生命科学有限公司）、Taq PCR Master Mix（2×dye blue，上海生工）、琼脂糖凝胶粉（上海生工）、4s Red Plus 核酸染色剂（10000×，上海生工）、DNA Marker（100～2 000bp）（上海生工）、叠氮钠（郑州派尼）、十二烷基硫酸钠（上海生工）、0.22μm 针头式滤过器（上海生工）。

1.3 耐碳青霉烯类PA 金属酶表型及基因筛选

1.3.1 耐碳青霉烯类PA 金属酶表型筛选 平板接种按照纸片扩散法（K-B 法）进行，以亚胺培南药敏纸片作为底物，滴加0.1M EDTA-Na2水溶液5mL，以滤纸为中心，在距滤纸25.00mm 左右的地方贴上亚胺培南药敏纸片作为阴性对照，37℃孵育过夜。阳性结果判读标准：EDTA 与亚胺培南复合纸片和单亚胺培南纸片抑菌圈直径差7.00mm[13]。

1.3.2 金属酶表型阳性PA 的金属酶基因鉴定 取过夜培养的细菌单克隆菌落于500mL TE 缓冲液中，使用水浴锅100℃加热10min，以10 000r/min 离心1min，上清液即为PCR 反应的DNA 模板。金属酶基因委托上海生工生物设计PCR 引物（见表1），反应体系为50μL，模板加入量为5μL。PCR 扩增循环参数：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s，延伸60s，35 个循环后，72℃延伸10min 终止反应。配制1%的琼脂糖电泳胶，进行电泳，观察电泳结果。对PCR 阳性扩增产物委托上海生工进行测序，将测序结果用NCBI Blast 工具与标准序列进行比对。

表1 PA 金属酶基因检测PCR 引物

1.4 质粒接合转移试验用二倍稀释法测定筛选出的金属酶阳性菌株对叠氮钠和大肠杆菌J53 对亚胺培南（Imipenem，IPM）的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC），叠氮钠的起始浓度为3 200μg/mL，IPM 的起始浓度为16μg/mL。以金属酶阳性PA 为供体菌，J53 为受体菌，在哥伦比亚血平板中进行三区划线，次日，挑取单克隆菌落，在10mL 的LB 肉汤（37℃，120rpm）中分别培养14h，然后100 倍稀释，并于37℃，120rpm 条件下继续培养4h。参考王明贵等[14]的方法，将共受体菌按照体积比为4:1 的比例置于37℃孵育过夜后，转移到添加2 000μg/mL 的叠氮钠和0.5μg/mL 的IPM 的LB 琼脂[11 株PA 对叠氮钠的最高MIC 为1 600μg/mL，平 均MIC 为（1 054.55±257.13）μg/mL，J53 对IPM的MIC＜0.25μg/mL]。培养基中若只有结合子生长则筛选成功，结合子验证测定菌株对亚胺培南的MIC。

1.5 黄连解毒汤对PA 接合性质粒消除试验

1.5.1 黄连解毒汤的配制 委托我院中药房制备黄连解毒汤。简要程序如下：取黄连解毒汤组方诸药30g（黄连9g，黄柏6g，黄芩6g，栀子9g，药量比为3:2:2:3），加纯净水1 200mL，浸泡1h，煎煮保持微沸1h，滤出煎液，药渣再各加920mL 纯净水，依次煎沸45min 和30min，合并3 次煎液浓缩至200mL，即得黄连解毒汤，以0.22μm 无菌滤器过滤。

1.5.2 产金属酶PA 耐药性逆转试验 准备8 个无菌离心管，1～6 管为实验组，第7 管为对照组，第8管为空白对照组。实验组：黄连解毒汤起始浓度为1 280mg/mL，以LB 肉汤对黄连解毒汤二倍梯度稀释至第6 管。对照组：第7 管加入5%的十二烷基硫酸钠。空白对照组：第8 管只加同等体积的LB液体培养基。1～8 管中各加入产金属酶PA 使其终浓度为5×105CFU/mL，37℃共孵育72h。选择24h，48h 和72h 这三个时间点亚抑菌浓度（即1/2 MIC）管里的菌液，分别进行100 倍稀释，用无菌枪头吸取10μL 稀释液，在LB 固体培养基中进行三区划线，37℃培养至次日。挑取300 个菌落进行影印培养，将其转种到含8μg/mL（CLSI-2023 M100 中PA对亚胺培南耐药折点）的IPM 平板和不含IPM 的平板中。消除子判定为在不含IPM 平板中生长，在含IPM 培养基中不生长，即不对亚胺培南耐药。消除率为消除子/300，结果以百分比表示。

2 结果

2.1 耐碳青霉烯类PA 金属酶表型及基因筛选结果在68 株耐碳青霉烯类PA 中，通过表型筛选出阳性菌株23 株，阳性率为33.82%（23/68），从23 株菌株中筛选金属酶基因阳性的有11 株（见图1），占阳性菌株的47.83%（11/23），这11 株菌株基因型均为blaIMP基因型，无blaNDM型。

图1 PA 金属酶blaIMP 基因型筛选结果

2.2 质粒接合转移试验从11 株blaIMP基因型为阳性的PA 中进行质粒接合转移试验，有3 株R 质粒接合试验阳性，占27.27%（3/11）。菌株编号分别为PA155、PA156、PA161。

2.3 黄连解毒汤对产金属酶PA 的MIC 黄连解毒汤对菌株PA155、PA156 和PA161 的MIC 分别为320mg/mL、320mg/mL 和160mg/mL。

2.4 黄连解毒汤对产金属酶PA 的质粒消除试验3株产金属酶PA PA155、PA156 和PA161 使用黄连解毒汤（实验组）处理24h 均无消除子产生；处理48h 产生消除子分别为2 株、3 株和2 株，平均消除率为0.78%；处理72h 产生消除子分别为5 株、5 株和4 株，平均消除率为1.56%。使用5%的SDS（对照组）处理24h 仅有PA161 产生1 株消除子，平均消除率为0.11%；处理48h PA155、PA156 和PA161产生消除子分别为10 株、4 株和8 株，平均消除率为2.44%；处理72h 产生消除子分别为8 株、4 株和5 株，平均消除率为1.89%（见表2）。

表2 黄连解毒汤和5%SDS 在不同时间下对产金属酶PA质粒的消除率（%）

3 讨论

PA 是导致院内感染的重要病原菌，在革兰氏阴性菌中的分离率仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，位列第三[15]。PA 属于革兰氏阴性非发酵菌，在各种环境中广泛分布。由于该菌对多种抗菌药物天然耐药，加之易获得性耐药，可引发多种严重感染，甚至危及生命，因此多重耐药PA 引起的感染性疾病已成为公共卫生医疗面临的巨大挑战[16]。PA 的耐药机制较为复杂，而金属酶导致的PA 耐药现象尤为严重[17～19]。产金属酶PA 在世界范围内的流行蔓延大大增加了院内感染患者数量，尤其是老年患者和免疫功能缺陷患者的发病率和死亡率上升，造成了沉重的经济负担和社会负担，对人类健康造成严重威胁[20]。

中草药在现代抗耐药菌感染方面治疗效果显著，黄连解毒汤作为清热解毒的经典方剂，因其对革兰氏阴性菌的主要致病物质-脂多糖诱导的病理损伤有显著的拮抗作用，因此证明其对耐药菌的感染具有潜在治疗作用[21]。本研究通过筛选出存在R 质粒的产金属酶PA，探究黄连解毒汤对产金属酶PA 的R 质粒的消除作用，证明黄连解毒汤可以消除R 质粒，恢复细菌对抗生素的敏感性。黄连解毒汤与使用5% SDS 相比，消除率要比SDS 低，但是SDS 毒性较强，而黄连解毒汤安全无毒，在临床应用广泛，与5% SDS 化学抑制剂相比，有更广阔的研究前景。